不同保存時間對于血液DNA提取質(zhì)量的影響

EDTA抗凝血液樣本中，經(jīng)3 000 rpm離心15 min后分為3層，上層為血漿，中間層為白膜層，下層紅細胞層。目前生物樣本庫將血細胞樣本統(tǒng)一處理后凍存于-80℃冰箱。如何獲取高質(zhì)量的DNA模板對隨后的分子實驗成敗具有決定作用；為保證DNA結(jié)構(gòu)完整，生理活性正常，一般對采集的新鮮樣本進行DNA提取最好，但由于實際情況的限制及課題開展的需要，多數(shù)樣本需置于冰箱中凍存積攢一定數(shù)量后方可取出統(tǒng)一使用[1-3]。隨著近年來生物樣本庫的發(fā)展，隨著凍存手段及凍存環(huán)境的改善，低溫凍存生物樣本的質(zhì)量得到了較大提高。本研究旨在通過對不同保存時間血細胞樣本的DNA提取質(zhì)量進行分析，為臨床樣本的采集方式提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗儀器：Thermo 臺式離心機，Thermo-80℃深低溫冰箱，Thermo Nanodrop 2000C超微量紫外分光光度計，天根T Guide M16全自動核酸提取儀，Bio-rad電泳儀（美國），Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)。實驗試劑：TGuide 血液基因組 DNA 提取試劑盒。

實驗材料：2014年1月采集的肘靜脈血。

1.2 方法

1.2.1 全血樣本前處理 將采集到的5 mL EDTA抗凝血4℃條件下3 000 rpm離心10 min。將其上清（約2.5 mL）吸取后凍存。小心吸取中間白膜500 μL于新的凍存管中。凍存不同時間之后取出白膜，融化后從500 μL白膜中吸取20 μL轉(zhuǎn)入無菌EP管中，并用PBS稀釋至200 μL后上機行DNA提取。

1.2.2 DNA提取 根據(jù)天根核酸提取儀中配套試劑盒說明書進行DNA提取。

1.2.3 DNA含量和純度檢測 紫外分光光度法測定基因組DNA的含量（ng/μL）以及波長為 260 nm和280 nm的吸光度值（OD260，OD280），根據(jù)OD260/OD280的比值來判斷DNA的純度。

1.3 瓊脂糖凝膠

利用1×TAE Buffer配置1.5%瓊脂糖凝膠。電泳槽中電泳液配置為0.5×TAE Buffer。電泳電壓設(shè)置為180 V，25 min。

1.4 觀察指標(biāo)

對不同保存方法的DNA得率、DNA完整性進行對比分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

每組樣品重復(fù)4～7份，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行分析，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多于兩組樣本均數(shù)的比較，采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nanodrop 檢測相同樣本來源不同保存方法所獲得DNA得率

新鮮白膜提取的DNA得率最高，為（36.30±4.31）ng/mL。凍存1年后得率顯著下降，為（18.84±2.40）ng/mL。隨著凍存時間的延長，全血DNA的得率呈下降趨勢，凍存1年的全血樣本與新鮮的血液樣本相比，得率下降幅度較大。而凍存2～4年期間，得率下降趨勢較為平緩。凍存2年得率為（14.94±3.73）ng/mL；凍存3年得率為（13.73±1.22）ng/mL；凍存4年得率為（13.85±3.51）ng/mL。通過t檢驗，分析對比不同凍存時間各組之間得率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見圖1a所示。如圖中所示，凍存1年的白膜樣本與新鮮全血白膜相比，其得率下降極顯著，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.624 1，P＜0.01）；凍存2年的白膜樣本與凍存 1 年的白膜樣本相比，其得率下降呈顯著水平（t=3.185 6，P＜0.05）；凍存2，3，4年的白膜樣本得率比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.521 4，P＞0.05），詳見圖1a。

2.2 Nanodrop檢測相同樣本來源及不同保存方法DNA的純度分析

所有抽取的DNA樣本OD260/OD280 比值在1.80～1.90之間，說明核酸提取儀提取的樣本純度全部達標(biāo)。凍存時間對于樣本的提取純度無顯著性影響，詳見圖1b。

圖1 不同凍存時間各組得率的差異顯著性及純度分析

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測不同保存時間白膜樣本的DNA完整性

每孔根據(jù)提取 Nanodrop測得的濃度設(shè)置不同點樣體積，保持點樣的DNA總量為50 ng以上。每組樣本提取得到的DNA樣本條帶清晰且單一，均無明顯降解現(xiàn)象。4-3條帶相對較暗，經(jīng)回溯對比，是由于4-3樣本提取的濃度較低，上樣量不夠?qū)е?，詳見圖2。

3 討論

圖2 不同凍存時間的白膜樣本 DNA 提取瓊脂糖凝膠電泳圖

血液在離開人體血液循環(huán)后會開始發(fā)生生理、結(jié)構(gòu)及功能的改變，且血液成分的改變及損傷程度與包括溫度、保存液種類、保存時間等多種因素相關(guān)；一般情況下，保存血液的損傷程度會隨著保存溫度的升高、保存時間的延長而遞增；且血液成分中損傷較小的是凝血酶原、纖維蛋白原等，損傷較為明顯的為白細胞、血小板等[4-6]。保存血液中成分損傷的基礎(chǔ)為膜蛋白和膜脂質(zhì)的含量及構(gòu)想等方面的改變，導(dǎo)致細胞通透性、細胞形態(tài)、細胞活性及細胞功能發(fā)生不可逆的改變，進而受損；研究發(fā)現(xiàn)，在不改變保存容器和保存液的條件下，血液成分損傷的速度會隨著保存溫度的改變而得到緩解；有研究發(fā)現(xiàn)，在同一保存條件下，4℃和0℃組相比，0℃組的膜收縮蛋白含量、膜的流動性及紅細胞形態(tài)等指標(biāo)均顯著優(yōu)于4℃組；由此可見，溫度和時間對血液保存至關(guān)重要[7-9]。

在實驗結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)凍存一年的樣本比新鮮白膜樣本得率顯著下降，有可能是由于凍存過程對于 DNA樣本的得率有影響。在生物樣本庫的管理中，下一步應(yīng)針對避免反復(fù)凍融來制定保護血液樣本DNA的凍存措施。本次提取的20 μL白膜其得率已可以滿足下一步的實驗要求。故后續(xù)保存時可以將白膜分裝到不同的凍存管中，以避免樣本的反復(fù)凍融。

經(jīng)過對不同凍存時間血液白膜樣本的 DNA提取發(fā)現(xiàn)，新鮮血液的白膜層提取獲得的DNA 得率較高，凍存 1 年后提取的得率有明顯下降趨勢，后續(xù)的三年凍存時間對于樣本 DNA 的提取得率影響不大，但對所有的樣本提取得到的 DNA 純度及完整性沒有顯著變化。這與Alexandre Bulla 等的報道一致[10]。分析原因，有可能是對于樣本的凍存操作對于DNA 的得率影響較大，凍存-融化過程會對DNA的得率造成一定影響[11]，后續(xù)實驗可以針對凍存-融化次數(shù)探究反復(fù)凍融對于DNA得率即完整性、純度的影響。僅僅是得率有所下降，而DNA的純度及完整性無顯著變化，說明樣本的質(zhì)量亦能夠滿足全基因組測序及下一代測序的要求[12]。

綜上所述，在-80℃保存的白膜樣本，在最初凍存時有可能會造成DNA數(shù)量上的損失，但對于純度及完整性影響不大。血液樣本長期的凍存可以滿足目前測序?qū)τ贒NA質(zhì)量的要求。