95%2甲4氯異辛酯原藥小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)研究

王 爽，紀(jì) 磊，徐 劍，岑江杰，林師道，方 華，錢浙斌

（浙江省化工研究院有限公司，浙江 杭州 310023）

2甲4氯異辛酯是一種激素型選擇性除草劑，具有較強(qiáng)的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，能和多種除草劑復(fù)配，防治水稻田、小麥田多種雜草。2甲4氯異辛酯屬于苯氧乙酸類除草劑，具有用量少、對(duì)敏感作物安全性高、對(duì)人畜等毒害作用較小的優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)除草領(lǐng)域中得到較廣的應(yīng)用。在使用時(shí)其附著性好，在植物體內(nèi)易分解成有效成分2甲4氯酸，傳輸速度更快，除草效果優(yōu)于同類產(chǎn)品2甲4氯鈉、2，4-D丁酯[1]，更重要的是雜草對(duì)其產(chǎn)生抗性的速度較為緩慢。目前對(duì)于95%2甲4氯異辛酯原藥及其混配制劑的毒理學(xué)研究幾乎未見報(bào)道。

微核（Micronucleus）是在細(xì)胞有絲分裂后期，不能進(jìn)入子代細(xì)胞核中的染色體的斷片或遲滯的染色體，在子代細(xì)胞胞漿內(nèi)形成的一個(gè)或幾個(gè)次核，其與細(xì)胞主核著色一致，呈圓形或橢圓形[2]。它是由染色體、染色單體的無(wú)著絲粒斷片或紡錘體損傷后造成滯后染色體在細(xì)胞分裂中未包被于主核中形成。在形態(tài)上，微核為完全游離于細(xì)胞漿中，染色及結(jié)構(gòu)與主核一致，直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5。斷裂作用和非整倍體化作用是微核產(chǎn)生的最主要的原因。通常認(rèn)為前者產(chǎn)生的微核主要由無(wú)著絲粒斷片形成，后者產(chǎn)生的微核則由整條染色體形成。但幾乎所有誘發(fā)微核的因素都兼有兩種作用。微核形成是細(xì)胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學(xué)終點(diǎn)，以觀察細(xì)胞中微核的形成來(lái)檢測(cè)遺傳毒物，稱為微核試驗(yàn)。該試驗(yàn)快速、簡(jiǎn)便，許多國(guó)家和國(guó)際組織都將其規(guī)定為評(píng)價(jià)農(nóng)藥 、新藥、食品添加劑等化合物毒理學(xué)評(píng)價(jià)的必做遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)之一[3]。

本研究應(yīng)用體內(nèi)哺乳動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)檢測(cè)95%2甲4氯異辛酯原藥致突變性，為其毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品

95%2甲4氯異辛酯原藥，褐色透明液體，無(wú)刺激性氣味，不溶于水，由國(guó)內(nèi)某作物保護(hù)公司提供。

1.2 動(dòng)物

SFF級(jí)ICR小鼠共60只，雌雄各半，體重25～30 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK＜京＞2016-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障設(shè)施內(nèi)，觀察及適應(yīng)3天，合格動(dòng)物用于試驗(yàn)。試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18℃～25℃。自由采食、飲水。SPF大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.3 試劑與器材

環(huán)磷酰胺（CP），批號(hào)為 120M1253V，生產(chǎn)廠家為SIGMA；甲醇，批號(hào)為2016102401，生產(chǎn)廠家為成都市科龍化工試劑廠；Giemsa染液 （自制），甘油（分析純），小牛血清。手術(shù)器械，帶油鏡頭顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社），細(xì)胞計(jì)數(shù)器等。

1.4 試驗(yàn)方法

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)按照《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》（GB/T 15670-2017）進(jìn)行操作[2]。本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得95%2甲4氯異辛酯原藥對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口LD50均為1470 mg/kg。本試驗(yàn)將60只小鼠隨機(jī)分成5組，每組12只，雌雄各半。分別為陰性對(duì)照組（玉米油，10 mL/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組 （環(huán)磷酰胺30 mg/kg腹腔注射）、低劑量組（200 mg/kg）、 中劑量組 （400 mg/kg）、 高劑量組（800 mg/kg）。陰性對(duì)照組（玉米油）和3個(gè)劑量組均按0.1 mL/10 g體重每天1次經(jīng)口灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組按0.1 mL/10 g體重每天1次腹腔注射。各給藥2次，間隔24 h。于第2次給藥后6 h頸椎脫臼處死動(dòng)物后，取胸骨，擠出骨髓液于載玻片小牛血清里，混勻，涂片自然晾干后放入甲醇中固定15 min，將固定好的涂片放入Giemsa染色約30 min，用蒸餾水沖洗，晾干。每組檢查5只動(dòng)物，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），并計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率以及嗜多染紅細(xì)胞與紅細(xì)胞總數(shù)的比例。嗜多染紅細(xì)胞微核率 （‰）=（含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)/嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)）×1000。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件，統(tǒng)計(jì)各組微核細(xì)胞率的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用泊松（Poisson）分布對(duì)各劑量組與陰性對(duì)照組的微核率進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

試驗(yàn)過(guò)程中各劑量組動(dòng)物染毒后2 d內(nèi)均未出現(xiàn)中毒癥狀。本試驗(yàn)所用ICR小鼠胸骨骨髓的自發(fā)微核千分率（‰）為0.80±0.98，各劑量組小鼠的微核率分別與陰性對(duì)照組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各劑量組雌雄動(dòng)物的微核率均小于2‰；而陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的微核率顯著地高于陰性對(duì)照組（P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核率雌雄動(dòng)物均不低于17‰。見表1。

表1 95%2甲4氯異辛酯原藥小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)ICR雌雄小鼠骨髓微核的自發(fā)率均小于3‰，陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺微核率與陰性對(duì)照組相差超過(guò)10倍，差異顯著，表明試驗(yàn)可行、可靠。在微核試驗(yàn)中常用環(huán)磷酰胺為誘變劑作陽(yáng)性對(duì)照，給藥劑量和取樣觀察時(shí)間對(duì)小鼠骨髓微核率的影響較大。根據(jù)體內(nèi)哺乳動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)（GB/T 15670.15-2017），取胸骨或股骨制片均可，環(huán)磷酰胺參考劑量和途徑為40 mg/kg（灌胃，ig）或 30 mg/kg（腹腔注射，ip）。有文獻(xiàn)報(bào)道用環(huán)磷酰胺作為誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核的陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，劑量可選擇60～90 mg/kg，取樣時(shí)間在給藥后36～48 h，采用一次腹腔注射、胸骨取材可取得較高微核率，結(jié)果令人滿意[4]。環(huán)磷酰胺經(jīng)口一次給藥時(shí)，其劑量范圍在40～80 mg/kg，采集樣本的時(shí)間應(yīng)在給藥后24～30 h，胸骨髓是微核試驗(yàn)的最好材料[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合實(shí)際情況，本試驗(yàn)取胸骨制片，環(huán)磷酰胺劑量和途徑為30 mg/kg（ip），取得了滿意的效果，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)各劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核率未見異常，表明95%2甲4氯異辛酯原藥對(duì)小鼠骨髓多染紅細(xì)胞無(wú)致突變作用。本試驗(yàn)為致突變的初篩試驗(yàn)，可為后續(xù)的毒理學(xué)試驗(yàn)提供參考，最終是否有遺傳毒性，還需要一系列的試驗(yàn)組合加以驗(yàn)證，如細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)等。