血栓心脈寧對血管性癡呆大鼠炎癥因子的影響

付佳宇 劉宏雁 謝宇

(吉林大學(xué) 1藥學(xué)院藥理教研室，吉林 長春 130021；2口腔醫(yī)院修復(fù)科)

血管性癡呆(VD)是常見的老年癡呆之一，是腦血管病導(dǎo)致腦損害所引起的獲得性智力障礙的一種臨床綜合征〔1〕。VD的發(fā)病機制復(fù)雜且誘因較多，目前臨床治療藥物依從性較差且并發(fā)癥較多，總體治療效果不理想，因此尋找切實有效、副作用少的藥物是目前研究的主要方向。血栓心脈寧是由丹參、川芎、牛黃、麝香、人參莖葉皂苷等多種中藥材制成的純中藥制劑，具有益氣活血、開竅止痛的作用，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、腦梗死等疾病〔2〕。本研究組先前實驗表明〔3〕，血栓心脈寧能夠改善雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠的學(xué)習記憶能力，減輕海馬及皮層的病理損傷。劉建偉等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，血栓心脈寧對雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠模型具有明顯的保護作用，其作用機制可能與抑制自由基損傷、改善血小板聚集有關(guān)。本研究將進一步闡明血栓心脈寧對永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈大鼠的保護作用，并從炎癥因子方面探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠150只，體重250～350 g。由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。合格證號：SCKK(吉)-2013-0001。

1.2實驗藥品及儀器 血栓心脈寧(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號：160404)；甲磺酸雙氫麥角毒堿片(天津華津制藥有限公司，批號：5K837T)；腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：AK0016SEP19006)、白細胞介素(IL)-1β ELISA試劑盒(批號：AK0016SEP19007)、IL-10 ELISA試劑盒(批號：AK0016SEP19008)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1 ELISA試劑盒(批號：AK0016SEP19009，晶美生物工程有限公司)。Morris水迷宮裝置(成都泰盟科技有限公司)、EMax Plus酶標儀(Molecular Devices)。

1.3造模和分組 采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法制作VD模型〔5〕，術(shù)后14 d將大鼠按體重隨機分為對照組、模型組(均灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液1 ml/100 g)、陽性對照組(甲磺酸雙氫麥角毒堿片，0.54 mg/kg)及血栓心脈寧小、中、大劑量組(0.55、1.10、2.20 g/kg)，連續(xù)灌胃給藥9 w。水迷宮實驗期間持續(xù)給藥。

1.4水迷宮實驗 連續(xù)7 d，前6天在1、2、3、4象限4個不同入水點，測定大鼠到達平臺的潛伏期、游程、朝向角及游泳速度；第7天撤掉平臺，測定大鼠在2 min內(nèi)經(jīng)過平臺次數(shù)、經(jīng)過有效區(qū)次數(shù)、平臺停留時間、有效區(qū)停留時間、平臺停留距離、有效區(qū)停留距離、平臺停留時間占總時間的百分比、平臺停留距離占總路程的百分比、有效區(qū)停留時間占總時間的百分比和有效區(qū)停留距離占總路程的百分比。

1.5大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量檢測 水迷宮實驗后，快速取出大鼠腦組織，將組織與冰生理鹽水按1∶9的重量體積比加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。2 200 r/min離心5～10 min，取上清組織勻漿，按測試指標要求分裝后于-20℃冰箱保存，采用ELISA檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮試驗結(jié)果 與對照組比較，模型組第2～6天到達平臺潛伏期及游程明顯延長(P<0.01或P<0.05)，第1～6天朝向角、游泳速度無顯著改變。第7天2 min內(nèi)穿過平臺、有效區(qū)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。平臺停留距離、平臺停留時間、有效區(qū)停留距離、有效區(qū)停留時間、平臺的停留時間占總時間的百分比、平臺的停留距離占總路程百分比、有效區(qū)的停留時間占總時間的百分比和有效區(qū)停留距離占總路程的百分比均明顯降低(P<0.01)。與模型組相比較，血栓心脈寧小劑量組第6天到達平臺游程明顯縮短(P<0.05)，中、大劑量組第3～6天到達平臺的潛伏期及游程明顯縮短(P<0.01或P<0.05)，血栓心脈寧各劑量組第1～6天朝向角、游泳速度無顯著改變。與模型組相比較，血栓心脈寧各劑量組在第7天2 min內(nèi)穿過平臺、有效區(qū)次數(shù)明顯增多(P<0.01或P<0.05)，血栓心脈寧小劑量組有效區(qū)停留距離、有效區(qū)停留時間、有效區(qū)停留時間占總時間百分比均明顯增高(P<0.05)，血栓心脈寧中、大劑量組平臺停留距離、平臺停留時間、有效區(qū)停留距離、有效區(qū)停留時間、平臺停留時間占總時間的百分比、平臺停留距離占總路程的百分比、有效區(qū)停留時間占總時間的百分比和有效區(qū)停留距離占總路程的百分比均明顯增高(P<0.01或P<0.05)， 見表1～5。

2.2各組腦組織TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量比較 與對照組比較，模型組腦組織中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比較，血栓心脈寧中、大劑量組TNF-α含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)；血栓心脈寧小、中、大劑量組IL-1β、IL-10含量顯著降低(P<0.01);血栓心脈寧大劑量組TGF-β1含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表1 各組潛伏期比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；同表2、表5、表6

表2 各組游程比較

表3 各組朝向角比較

表4 各組平均速度比較

表5 各組第7天各項指標比較

表6 各組腦組織TNF-α、IL-1β含量比較

3 討 論

炎癥機制在VD的發(fā)病中逐漸受到重視。炎癥反應(yīng)可修復(fù)受損組織，具有神經(jīng)保護作用，但過度表達則會加重腦組織損傷〔6〕。

當VD時腦組織缺血，內(nèi)皮細胞和周圍神經(jīng)元激活釋放大量的前炎癥因子TNF-α、 IL-1β〔7〕。TNF-α和IL-1β是促炎癥的起始調(diào)節(jié)因子，在觸發(fā)炎癥級聯(lián)中處于中心位置。TNF-α能夠協(xié)同IL-1β誘導(dǎo)其他細胞因子的產(chǎn)生〔8〕。IL-1β還可通過NF-κB途徑促使膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、一氧化氮(NO)等對神經(jīng)細胞具有毒性的物質(zhì)〔9〕，從而引起細胞因子、毒性介質(zhì)的堆積，誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，從而進一步加重VD。研究發(fā)現(xiàn)〔10～12〕，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎VD大鼠模型腦組織中TNF-α、 IL-1β含量較正常對照組明顯升高。反映TNF-α、IL-1β是加重雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎VD大鼠炎癥反應(yīng)的重要細胞因子。楊曉霞等〔13〕研究證明，血栓心脈寧能夠明顯抑制缺血再灌注模型大鼠腦組織中TNF-α及其相關(guān)因子的分泌和表達，減輕炎癥反應(yīng)，保護腦組織。TGF-β是一種多功能細胞因子，與TNF-α的變化具有相關(guān)性，可影響多種細胞的生長、分化、細胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能〔14〕。李艷玲等〔15〕研究表明，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎VD大鼠模型腦組織海馬區(qū)TGF-β表達增高。IL-10在炎癥反應(yīng)中主要起激活淋巴細胞的作用。升高時會造成異常碎片在患者腦中斑塊沉積，引起腦內(nèi)神經(jīng)毒素的產(chǎn)生，從而引起神經(jīng)損傷。熊濤等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，VD患者血清中IL-10水平與正常對照組相比明顯升高。本實驗結(jié)果進一步證實了血栓心脈寧對VD具有保護作用。另外TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IL-10作為炎癥因子參與了VD的形成?？傊?，血栓心脈寧對VD有改善學(xué)習記憶的作用，其作用機制可能與對抗炎癥反應(yīng)、抑制炎癥細胞因子釋放有關(guān)，但其確切機制有待于進一步研究。