基于生物信息挖掘MicroRNA-circRNA作為胃癌潛在標(biāo)志物

韓銀淑

(廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023)

胃癌(GC)是世界范圍內(nèi)臨床死亡率高的惡性腫瘤之一，在全球癌癥死亡率位列第三〔1,2〕，中國(guó)是全球GC發(fā)病率最高的國(guó)家之一〔3〕，GC已對(duì)我國(guó)人民的健康構(gòu)成巨大威脅〔4，5〕。環(huán)狀RNA(circRNA)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的新型內(nèi)源性非編碼RNA。主要由內(nèi)含子和(或)內(nèi)含子構(gòu)成，作為非編碼RNA家族的新成員，具有結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定、物種高度保守性以及組織、細(xì)胞的特異性等特征，目前這些RNAs的作用和使命尚未完全揭示〔6〕。與傳統(tǒng)的線性RNA(包括5′端和3′端)不同，circRNA分子處于閉環(huán)結(jié)構(gòu)，因此與線性RNA相比，不易被外切核酸酶RNaseR降解〔7〕，更為穩(wěn)定，更適合作為腫瘤的標(biāo)志物。一些circRNA分子含有作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)的miRNA反應(yīng)元件(MRE)，與miRNA結(jié)合，circRNA主要通過miRNA海綿作用調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)時(shí)，抑制目標(biāo)基因表達(dá)〔8〕。這些非編碼RNA(ncRNA)ncRNA與腫瘤的發(fā)生，侵襲和遷移及耐藥密切相關(guān)〔9，10〕。在許多研究中，我們發(fā)現(xiàn)circRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔11〕。然而，circRNA在GC中的作用尚未闡明。本研究使用miRNA芯片尋找差異miRNA，并預(yù)測(cè)與GC相關(guān)的circRNA，最終確定早期篩查GC的潛在靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1微陣列芯片分析 使用GEO2R軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析miRNA芯片數(shù)據(jù)。在所有實(shí)驗(yàn)組中，差異表達(dá)的基因，miRNA通過顯著性水平P<0.05或| logFC |> 1來鑒定。

1.2miRNA在GC細(xì)胞表達(dá)驗(yàn)證 根據(jù)組織/細(xì)胞miRNA提取試劑盒(?；袊?guó)，B1802)操作步驟常規(guī)提取細(xì)胞中的miRNA，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(?；?，中國(guó)，D1801)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)下列條件進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，溶解曲線：95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s，60℃15 s。引物為hsa-miR-769-5p-正義鏈：GGCTGAGACCTCTGGGTTC，hsa-miR-769-5p-反義鏈：CAGTGCGTGTCGTGGAGT(Invitrogen 中國(guó)，上海)。

1.3circRNA-microRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò) 為了進(jìn)一步闡明基因，microRNA，circRNA之間的相關(guān)性，進(jìn)行潛在的基因-microRNA-circRNA相互作用分析，并用Cytoscape繪制圖譜。

1.4網(wǎng)絡(luò)建設(shè)和分析 關(guān)于miRNA基因相互作用的信息是使用Cytoscape上相互作用的miRNA基因的檢索工具(v.3.5.1)推導(dǎo)。關(guān)于miRNA-circRNA相互作用是使用搜索工具(https://circinteractome.nia.nih.gov/)。用miRNA作為目標(biāo)來預(yù)測(cè)與circRNA的相互作用，而在預(yù)測(cè)過程中，我們只保留環(huán)境分?jǐn)?shù)百分位≥90%的circRNAs。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1通過生物信息學(xué)分析鑒定GC的micRNA芯片 使用GEO2R方法的GEO數(shù)據(jù)庫篩選GC患者的差異表達(dá)的micRNA芯片(GSE30070)。我們發(fā)現(xiàn)來自正常和GC患者的差異表達(dá)的micRNA，其中 93個(gè)miRNA上調(diào)，64個(gè)miRNA下調(diào)。將差異最大的前30個(gè)上調(diào)和下調(diào)miRNA以表格形式列出(表1)。

2.2在GC細(xì)胞中驗(yàn)證hsa-miR-769-5p的表達(dá)水平 在正常胃細(xì)胞(GES-1)和GC細(xì)胞系(GES-1、AGS、MKN-45、MKN-28、MGC-803、SGC-7901)及順鉑耐藥GC細(xì)胞(SGC-7901/CDDP)中進(jìn)行驗(yàn)證，qPCR結(jié)果顯示miR-769-5p在正常胃細(xì)胞(GES-1)中表達(dá)水平較低，在GC細(xì)胞系中表達(dá)均增高，特別是在SGC-7901表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞。同時(shí)，與GES-1細(xì)胞相比，miR-769-5p的水平在SGC-7901/CDDP細(xì)胞中表達(dá)也明顯增加，但低于SGC-7901組(圖1)。

表1 在GC組織差異表達(dá)的miRNA

1～7:GES-1、AGS、MKN-28、MKN-45、MGC-803、8GC-7901、SGC-7901/CDDP圖1 miR-769-5p在各細(xì)胞中的表達(dá)

2.3在GC中miRNA與circRNA的相互作用 在驗(yàn)證GC和耐藥GC細(xì)胞中的差異表達(dá)基因之后，我們確定了關(guān)鍵調(diào)控靶基因，其中下調(diào)基因均顯示與miR-769-5p相互作用。因此，我們選擇miR-769-5p為核心調(diào)控miRNA，并進(jìn)一步對(duì)其互作靶向circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。同時(shí)篩選GSE78092、GSE10070微陣列芯片中GC組織與正常胃組織差異的circRNA，并用circBase(http://www.circbase.org/)分析結(jié)果，其中GC組織中有53個(gè)circRNAs上調(diào)，146個(gè)circRNAs下調(diào)。在GSE10070芯片中，GC組織中有191個(gè)circRNAs上調(diào)，522個(gè)circRNAs下調(diào)〔12〕。表-1列出了這兩個(gè)芯片中差異最大的前30個(gè)上調(diào)和下調(diào)的circRNA。我們使用Circular RNA Interactome在線分析軟件(https://circinteractome.nia.nih.gov/)。對(duì)于預(yù)測(cè)結(jié)果，我們保留分?jǐn)?shù)百分比≥90%的circRNA，見表2。最后篩選出與芯片共存的circRNA，最終繪制出相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

表2 與hsa-miR-769-5p相互作用的circRNA和靶基因預(yù)測(cè)

圖2 miR-769-5p與circRNA相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

circRNA可以作為miRNA“海綿”來調(diào)控基因表達(dá)水平。因此，我們使用ArraystarcircRNA interaction-miRNA預(yù)測(cè)軟件來分析circRNA與其靶miRNA的相互作用。結(jié)果顯示17個(gè)circRNA可以與miR-769-5p結(jié)合。此外，我們使用Cytoscape軟件構(gòu)建了一個(gè)完整的miRNA/circRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。我們相信這些miRNAs/circRNAs的相互作用存在于GC組織中。因此，在GC中使用circRNA作為潛在的診斷靶標(biāo)。單獨(dú)或與miR-769-5p組合的circRNA可提供更早且更準(zhǔn)確的GC敏感性的鑒定。這些結(jié)果可以改善GC患者的臨床治療，為藥物治療提供診斷指標(biāo)。