調(diào)控靶向Xklp2表達(dá)對肺鱗癌細(xì)胞放射線照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響

楊潔 祝淑釵 王玉祥 管金磊 王濤 于凡 甄嬋軍 王肖肖

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 1放療科，河北 石家莊 050011；2胸外科；3病理科)

放射治療是肺鱗狀細(xì)胞癌主要治療方法之一。靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)是Xklp2的靶蛋白，參與有絲分裂期紡錘體的組裝，維持紡錘體的完整性，其表達(dá)受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控〔1〕。TPX2在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)〔2〕，并且與腫瘤的預(yù)后有關(guān)〔3〕，TPX2高表達(dá)者預(yù)后較差。最近研究提示〔4〕，TPX2參與調(diào)控照射后DNA損傷修復(fù)，能夠抑制DNA損傷應(yīng)答中關(guān)鍵分子H2AX的磷酸化，TPX2高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞放射敏感性較低。前期研究通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)TPX2表達(dá)增加肺鱗癌細(xì)胞的放射敏感性〔5〕，在此基礎(chǔ)上，本研究擬探討調(diào)控TPX2表達(dá)對肺鱗癌細(xì)胞照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)及細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)激酶DNA損傷監(jiān)測點(diǎn)介質(zhì)(MDC)1斑點(diǎn)形成的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 人肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1和NCI-H226，分別購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫和上海中喬新舟生物公司。

1.2主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶細(xì)胞消化液，購自美國Gibco公司；新生小牛血清，購自美國Hyclone Laboratories公司；TPX2抗體(單抗)，購自中國Proteintech公司，11741-1-AP；γ-H2AX抗體(單抗)，購自英國Abcam公司，ab2893；MDC1抗體(單抗)，購自中國生工公司，D161023；RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛，購自生工生物工程(上海)有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，購自美國SHEL-LAB公司；H-2050R超速冷凍離心機(jī)，購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BX53熒光顯微鏡，購自日本PLYMPUS公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞培養(yǎng) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TPX2 shRNA質(zhì)粒的SK-MES-1細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TPX2過表達(dá)質(zhì)粒的NCI-H226細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建〔5〕。細(xì)胞組別分為SK-MES-1陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照序列的SK-MES-1細(xì)胞)、TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染TPX2 shRNA的SK-MES-1細(xì)胞)、NCI-H226空載體組(轉(zhuǎn)染空載體的NCI-H226細(xì)胞)和TPX2過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染TPX2過表達(dá)質(zhì)粒的NCI-H226細(xì)胞)。SK-MES-1陰性對照組和TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組SK-MES-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中，NCI-H226空載體組和TPX2過表達(dá)組NCI-H226細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，均添加1%青-鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞孵箱中孵育，每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合度時傳代。

1.4細(xì)胞γ-H2AX蛋白的測定 各組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，用6MV-X線(2.0 Gy/min)照射，照射野10 cm×10 cm，源皮距100 cm，4 Gy照射后0～24 h采用Western印跡檢測γ-H2AX蛋白表達(dá)。采用RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，采用BCA法測定各組蛋白濃度。蛋白樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。按蛋白量40 μg/孔進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，予5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入1∶1 000稀釋的γ-H2AX單克隆抗體，4℃孵育過夜。Tris緩沖鹽溶液(TBST)洗膜，加入IgG-HRP，37℃下孵育，TBST緩沖液充分洗膜，應(yīng)用ECL 發(fā)光試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色5 min，暗室曝光顯影。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.5細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)的觀察 將SK-MES-1陰性對照組、TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組SK-MES-1細(xì)胞、NCI-H226空載體組和TPX2過表達(dá)組NCI-H226細(xì)胞離心，加入1 ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)。將細(xì)胞分別接種于鋪有爬片的12孔板，細(xì)胞生長密度至90%時接受4 Gy照射，4 h后收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，滴加0.1% TritonX-100，置于細(xì)胞室孵育。PBS洗滌細(xì)胞爬片，加入γ-H2AX單克隆抗體和MDC1抗體，至細(xì)胞被完全覆蓋，4℃孵育過夜。PBS洗滌細(xì)胞爬片，避光加入IgG-HRP，室溫下孵育。PBS洗滌，滴加4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)至細(xì)胞被完全覆蓋。PBS洗滌，加抗熒光淬滅劑，封片，在熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TPX2 干擾對SK-MES-1細(xì)胞放射線照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響 4 Gy照射后0～24 h ，SK-MES-1細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)水平先升高，后逐漸降低，在照射后4 h達(dá)到峰值。與SK-MES-1陰性對照組相比，未照射TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組 SK-MES-1細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，照射后15 min至24 h， TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組中γ-H2AX蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。下調(diào)TPX2表達(dá)使SK-MES-1細(xì)胞照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯增加，與單純照射組(SK-MES-1陰性對照組接受放射線照射后)比較，峰值明顯升高，蛋白表達(dá)下降程度減低。見圖1，表1。

2.2TPX2過表達(dá)對NCI-H226細(xì)胞放射線照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響 4 Gy 照射后0～24 h ，NCI-H226細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)先升高，后逐漸降低，在照射后2 h達(dá)到峰值。與NCI-H226空載體組相比，照射后0～24 h，TPX2過表達(dá)組γ-H2AX蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，與SK-MES-1細(xì)胞不同，在未接受照射時，NCI-H226空載體組與TPX2過表達(dá)組即有顯著性差異(P<0.05)。過表達(dá)TPX2，照射后NCI-H226細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)增高幅度降低。見表2，圖2。

1,2：SK-MES-1陰性對照組；TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組圖1 下調(diào)TPX2對SK-MES-1細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響

組別0 h15 min1 h2 h4 h12 h24 hSK-MES-1陰性對照組1.04±0.092.23±0.202.46±0.192.63±0.213.23±0.272.74±0.261.71±0.24TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組 SK-MES-1細(xì)胞1.35±0.132.96±0.21)3.04±0.251)4.24±0.242)5.08±0.242)4.83±0.322)4.27±0.262)

與SK-MES-1陰性對照組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

表2 過表達(dá)TPX2對NCI-H226細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響

與NCI-H226空載體組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3TPX2 干擾對SK-MES-1細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)形成的影響 熒光顯微鏡下各組細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，γ-H2AX和MDC1呈紅色熒光并定位于胞核。照射前TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組和SK-MES-1陰性對照組細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)無明顯差異，照射后4 h，兩組細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)均明顯增加，與SK-MES-1陰性對照組相比，TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染組γ-H2AX和MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)量明顯高于單純照射組(SK-MES-1陰性對照組受到放射線照射后的情況)。見圖3。

2.4TPX2過表達(dá)對NCI-H226細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)形成的影響 熒光顯微鏡下各組細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，γ-H2AX和MDC1呈紅色熒光并定位于胞核。照射前TPX2過表達(dá)組和NCI-H226空載體組細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)無明顯差異，照射后4 h，兩組細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)均明顯增加，與NCI-H226空載體組相比，TPX2過表達(dá)組γ-H2AX和MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)量顯著低于單純照射組(NCJ-H226空載體組接受放射線照射后的情況)。見圖4。

1，2：NCI-H226空載體組；TPX2過表達(dá)組圖2 過表達(dá)TPX2對NCI-H226細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響

圖3 下調(diào)TPX2表達(dá) SK-MES-1細(xì)胞核中γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)的表達(dá)(×400)

圖4 過表達(dá)TPX2 NCI-H226細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)的表達(dá)(×400)

3 討 論

最近研究提示TPX2在放射線引起的DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用〔4，6〕，TPX2能夠抑制DNA損傷應(yīng)答中關(guān)鍵分子H2AX的磷酸化，TPX2高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞放射敏感性較低。我們前期研究中也發(fā)現(xiàn)放射抗拒肺鱗癌細(xì)胞中TPX2表達(dá)較高，通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)TPX2表達(dá)后，SK-MES-1細(xì)胞的放射敏感性明顯增加，相反，過表達(dá)TPX2、NCI-H226細(xì)胞的放射敏感性降低〔5〕。為了進(jìn)一步研究TPX2調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制，本研究觀察了調(diào)控TPX2對照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)未照射時各組均存在一定量的γ-H2AX蛋白表達(dá)，照射后γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯升高，其24 h內(nèi)呈先升高后降低的趨勢。既往Shi等〔7〕研究結(jié)果顯示，照射后食管癌細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯增加，呈時間劑量依賴性關(guān)系；Liang等〔8〕及劉瑩等〔9〕研究認(rèn)為，TPX2 shRNA轉(zhuǎn)染后肝癌及肺腺癌的凋亡率顯著升高；Neumayer 等〔4，10〕研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染聯(lián)合照射后，低表達(dá)TPX2的宮頸癌Hela細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)顯著升高；而過表達(dá)TPX2的宮頸癌Hela細(xì)胞及乳腺癌MCF-7細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯降低。以上結(jié)果均與本研究一致，推測TPX2影響肺鱗癌細(xì)胞的放射敏感性，可能與γ-H2AX蛋白的磷酸化水平有關(guān)。

另外，研究表明細(xì)胞受到電離輻射后，H2AX第139位絲氨酸殘基迅速被磷酸化激活，形成γ-H2AX，聚集在DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)〔11〕。被磷酸化激活的H2AX(γ-H2AX)進(jìn)一步活化下游相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白MDC1等〔12〕，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。在DNA雙鏈斷端通過熒光顯微鏡觀察到γ-H2AX、MDC1等DNA損傷應(yīng)答分子的聚集。因此，可以認(rèn)為放射線或其他外源性細(xì)胞毒作用引起的細(xì)胞DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為可見的核內(nèi)斑點(diǎn)〔13〕。其中，γ-H2AX斑點(diǎn)是DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志〔14〕，4 Gy照射后，H2AX磷酸化所形成的核內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)量與放射線導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)存在線性關(guān)系〔15〕。γ-H2AX斑點(diǎn)的動力學(xué)特點(diǎn)存在劑量依賴性和時間依賴性，γ-H2AX斑點(diǎn)的消退代表DNA損傷修復(fù)〔16〕，照射后核內(nèi)斑點(diǎn)的變化可以反映細(xì)胞的修復(fù)能力〔17〕。本研究顯示，4 Gy照射后4 h，下調(diào)TPX2表達(dá)，使SK-MES-1細(xì)胞中γ-H2AX和MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)明顯增加，而過表達(dá)TPX2，則減少了NCI-H226細(xì)胞核內(nèi)斑點(diǎn)的形成，與Neumayer等〔4〕研究結(jié)果一致，下調(diào)TPX2表達(dá)增加骨肉瘤U2OS細(xì)胞4 Gy照射后γ-H2AX核內(nèi)斑點(diǎn)的數(shù)量，照射后1 h及2 h時增加更明顯；而過表達(dá)TPX2抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞中MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)的形成，提示調(diào)控TPX2表達(dá)，影響細(xì)胞的放射敏感性，可能與照射后肺鱗癌細(xì)胞的修復(fù)能力改變有關(guān)。綜上，TPX2能夠調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞放療敏感性，主要表現(xiàn)為H2AX磷酸化，γ-H2AX和MDC1斑點(diǎn)形成發(fā)生變化。