FOXC2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響及機(jī)制

張洋 張磊 吳慧麗 李琨琨

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450007)

結(jié)腸癌發(fā)病早期超過90%的患者可以通過手術(shù)治療治愈，但由于結(jié)腸癌早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)處于結(jié)腸癌的中晚期，耽誤了最佳的治療時(shí)機(jī)〔1〕。探討結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的靶基因治療結(jié)腸癌是目前研究的熱點(diǎn)。叉頭框(FOX)C2是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控小鼠胚胎發(fā)育和淋巴發(fā)育，在食管癌、大腸癌等中表達(dá)上調(diào)，并且與癌癥的預(yù)后、轉(zhuǎn)移等有關(guān)〔2～4〕。研究顯示，F(xiàn)OXC2在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、上皮細(xì)胞間充質(zhì)化(EMT)、血管生成等過程中均具有調(diào)控作用，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控基因〔5〕。本研究旨在探討FOXC2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力的影響，明確FOXC2在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌細(xì)胞SW620購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)；shRNA對(duì)照、FOXC2 shRNA為圣克魯斯生物技術(shù)產(chǎn)品；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó) Invitrogen公司產(chǎn)品；FOXC2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工合成；FOXC2一抗、鈣黏蛋白E(E-cadherin)一抗均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2一抗、MMP-9一抗均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Thermo。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞SW620從液氮中取出放在37℃融化后，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液混合后，種植到細(xì)胞瓶中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)要求不同比例接種到細(xì)胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，將FOXC2 shRNA和shRNA對(duì)照按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中并依次命名為：FOXC2 shRNA組和shRNA-NC組，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞不予處理正常培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，Real time-PCR和Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中FOXC2水平。

1.4Real time-PCR檢測(cè)E-cadherin水平 取1.3中對(duì)照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化后，提取細(xì)胞中的RNA，加入14 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。取2 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real time-PCR，以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法分析FOXC2水平。FOXC2上游引物為5′-TTCAGAAGGTGGCTCAATGC-3′，下游引物5′-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATTAC-3′。GAPDH上游引物為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATAC-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5Western印跡檢測(cè)FOXC2、MMP-2、MMP-9和E-cadherin蛋白水平 取1.3中對(duì)照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。按照每孔40 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，將蛋白與加樣緩沖液在振蕩器上混合后，放在100℃煮沸5 min，保存在4℃。用10%的分離膠和4%的濃縮膠進(jìn)行電泳，在分離膠中的電壓為120 V，在濃縮膠中的電壓為80 V。半干法在4℃，0.8 mA/cm2把蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。取出PVDF膜，用5%的脫脂奶粉在室溫封閉1 h后，放在1∶800稀釋的一抗中4℃過夜反應(yīng)，在1∶1 500稀釋的二抗中室溫反應(yīng)1 h。顯色，曝光，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/ml，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。每孔中加入50 μl的濃度為5 mg/ml噻唑藍(lán)(MTT)溶液，37℃靜置反應(yīng)4 h。以不加細(xì)胞的孔為空白調(diào)零組。將培養(yǎng)液上清吸除后，每孔加150 μl的二甲基亞砜溶液，震蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A值，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7平板克隆檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 對(duì)照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入200個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)14 d以后，用肉眼觀察細(xì)胞克隆數(shù)目。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，甲醇固定，吉姆薩染色后，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8Transwell小室檢測(cè)遷移和侵襲能力 對(duì)照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml。在實(shí)驗(yàn)前3 h，取基質(zhì)膠加入到Transwell小室中，放置于37℃環(huán)境中孵育濕化3 h，待基質(zhì)膠凝固以后，在小室中加入不含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育40 min。取適量的細(xì)胞懸浮液加入Transwell小室中，放在24孔板中。小室外側(cè)加入細(xì)胞培養(yǎng)液。37℃孵育48 h后，用PBS洗滌Transwell小室，把沒有穿膜的細(xì)胞用棉簽擦掉，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞遷移能力檢測(cè)時(shí)Transwell小室不用基質(zhì)膠包被，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.9數(shù)據(jù)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組FOXC2表達(dá)水平比較 shRNA-NC組細(xì)胞中FOXC2 mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FOXC2 shRNA組細(xì)胞FOXC2 mRNA和蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1，表1。

1:對(duì)照組;2:shRNA-NC組;3:FOXC2 shRNA組圖1 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FOXC2水平

組別mRNA蛋白對(duì)照組1.00±0.110.69±0.09shRNA-NC組1.01±0.080.68±0.06FOXC2 shRNA組0.47±0.091)0.14±0.031)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；表2同

2.2各組細(xì)胞增殖和克隆形成能力、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目及MMP-2、MMP-9及E-cadherin水平比較 shRNA-NC組細(xì)胞A值、克隆形成數(shù)目、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目及MMP-2、MMP-9和E-cadherin水平與對(duì)照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FOXC2 shRNA組細(xì)胞A值和克隆形成數(shù)目、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目及MMP-2、MMP-9水平均顯著低于對(duì)照組，E-cadherin水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖2、表2。

1:對(duì)照組；2:shRNA-NC組；3：FOXC2 shRNA組圖2 Western印跡檢測(cè) MMP-2、MMP-9和E-cadherin水平

組別A值克隆形成數(shù)目(個(gè))遷移數(shù)目(個(gè))侵襲數(shù)目(個(gè))MMP-2MMP-9E-cadherin對(duì)照組0.75±0.0727.33±2.64186.75±16.97162.84±15.681.17±0.101.06±0.110.84±0.08shRNA-NC組0.76±0.0425.91±3.12188.26±17.34166.47±12.741.15±0.131.03±0.120.87±0.04FOXC2 shRNA組0.52±0.061)14.80±1.751)125.08±11.821)114.56±13.621)0.41±0.061)0.58±0.061)1.36±0.161)

3 討 論

FOXC2基因最初分離至小鼠腦組織中，因其含有FOX結(jié)構(gòu)而命名〔6〕。人FOXC2基因定位在16q22～16q24，不含有內(nèi)含子，只有一個(gè)單獨(dú)的外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)由494個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)forkhead結(jié)構(gòu)，對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用〔7,8〕。FOXC2對(duì)腫瘤的作用機(jī)制與血管生成、血管生成因子、EMT等有關(guān)〔9〕。FOXC2在黑色素瘤中可以通過調(diào)控血管生成影響腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，皮下注射黑色素瘤細(xì)胞后，F(xiàn)OXC2雜合突變的小鼠腫瘤血管生成能力低于野生型的小鼠，并且雜合突變小鼠MMP-2和MMP-9的水平也下降〔10〕。研究顯示，F(xiàn)OXC2能夠通過調(diào)控其他相關(guān)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄間接降低腫瘤細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)〔11〕。

FOXC2在卵巢癌、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、食管鱗癌等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔12～14〕。王靜苗等〔15〕研究表明，在70例結(jié)腸癌患者中有52例FOXC2表達(dá)陽(yáng)性，而在30例癌旁組織中只有6例FOXC2表達(dá)陽(yáng)性，并且其表達(dá)水平與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)深度等有關(guān)。權(quán)原〔16〕研究表明，下調(diào)FOXC2對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的侵襲、遷移具有抑制作用，并且對(duì)卵巢癌細(xì)胞的裸鼠成瘤能力也具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)FOXC2表達(dá)后的結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成能力下降，細(xì)胞的侵襲和遷移能力也下降，F(xiàn)OXC2下調(diào)后抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力，這與上述實(shí)驗(yàn)報(bào)道相符合，F(xiàn)OXC2在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。

腫瘤的轉(zhuǎn)移過程較為復(fù)雜，癌細(xì)胞侵襲是發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移的前提條件，而隨著癌細(xì)胞侵襲的發(fā)生，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移〔17〕。癌細(xì)胞從原來的病發(fā)灶擴(kuò)散進(jìn)入到鄰近的正常組織器官中必須通過癌細(xì)胞的黏附作用才能實(shí)現(xiàn)，癌細(xì)胞到達(dá)血管內(nèi)皮下基底膜，進(jìn)入血液中，并且隨著血液的擴(kuò)散達(dá)到其他組織中，在靶器官內(nèi)皮細(xì)胞上黏附以后，克隆生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移灶〔18〕。細(xì)胞的黏附作用有兩種：細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附和細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附，E-cadherin是細(xì)胞間黏附作用的關(guān)鍵因子，屬于鈣依賴的跨膜糖蛋白〔19〕。研究顯示，E-cadherin在癌癥組織中低表達(dá)，E-cadherin水平還與癌癥的預(yù)后有關(guān)〔20〕。腫瘤細(xì)胞在侵襲和遷移發(fā)生時(shí)，需要通過MMPs降解相鄰的細(xì)胞外基質(zhì)才能完成〔21〕。MMP-2、MMP-9在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是目前研究的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的MMPs家族成員。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2表達(dá)下調(diào)后的結(jié)腸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，而E-cadherin表達(dá)水平升高，說明FOXC2通過作用于MMP-2、MMP-9、E-cadherin影響結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程。

綜上，F(xiàn)OXC2表達(dá)下調(diào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力，下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白水平，促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，F(xiàn)OXC2表達(dá)下調(diào)抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，對(duì)于其具體的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探討。