BMSCs與VEGF結(jié)合藻酸鈣支架治療兔早期股骨頭壞死的療效

季慶輝 喬建民 薛宇 劉士臣 喬曉峰 姬宇輝 李恒威

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目前糖皮質(zhì)激素是導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死第二因素，患病率可高達(dá)38%〔1〕。而且激素可導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的活性減退，因此BMSCs和激素性骨頭壞死有一定的相關(guān)性，目前對(duì)股骨頭壞死沒(méi)有有效的手段。本研究髓芯減壓兔早期股骨頭壞死模型，把BMSCs和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合藻酸鈣支架移植到減壓區(qū)，觀察壞死區(qū)的變化。

1 材料與方法

1.1一般資料 60只3.0 kg新西蘭大白兔4～5月齡，保存在一個(gè)溫控房間(23℃)隨意提供食物和水。本研究經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)同意，并按照佳木斯大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理法律執(zhí)行實(shí)施。

1.1.1激素性股骨頭壞死模型制備〔2〕首先按1 kg兔子注射脂多糖10 μg的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈注射，1 d后在臀部肌肉注射甲潑尼龍，按每1 kg體重注射20 mg的劑量注射，共3 d，6 w后選出成功的模型。最終除去死亡和失敗模型，共剩54只。將其隨機(jī)分成激素性股骨頭壞死組(A組)；單純減壓組(B組)；減壓后植入BMSCs(C組)；減壓后植入BMSCs及VEGF(D組)；減壓+帶有BMSCs的藻酸鈣支架(E組)；減壓后+帶有VEGF、 BMSCs的藻酸鈣支架(F組)，各9只。

1.1.2兔骨BMSCs分離培養(yǎng) 按Pittenger等〔3〕方法，取自新西蘭兔自體，耳緣靜脈注射戊巴比妥麻醉后，用碘伏消毒髂骨處，用骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓共約5 ml；用吸管進(jìn)行吹打，制成細(xì)胞懸液，采用密度梯度離心，2 000 r/min離心20 min后用吸管取中層有核細(xì)胞層，再將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.1.3藻酸鈣支架的制備〔4〕將102mmol/L CaCl2溶液和1.2%藻酸鈉溶液用2 000 r/min禍旋混合器橫拌，快速充分混合15 s?；旌虾蟮娜芤悍湃肭蛐湍＞咧兴苄?0 min制成三維支架。pH值調(diào)為7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法 用陸眠寧0.2 ml·kg-1·BW-1將兔麻醉后，取仰臥位，穿刺部位備皮、消毒，鋪巾。切開(kāi)后，在X線(xiàn)下用電鉆鉆入股骨頭中心部位。

1.3觀察指標(biāo) (1)進(jìn)行對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)觀察；(2)病理組織學(xué)觀察：每組切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，通過(guò)觀察骨陷窩和血管數(shù)目了解股骨頭壞死區(qū)域的修復(fù)情況；(3)股骨頭X線(xiàn)檢查：4、8 w檢測(cè)待兔麻醉后，仰臥于X線(xiàn)檢查桌上，將髖關(guān)節(jié)置于中心，觀察股骨頭區(qū)變化情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的生長(zhǎng)觀察結(jié)果 如圖1所示，培養(yǎng)5 d后，可見(jiàn)大量BMSCs貼壁生長(zhǎng)。傳代3～7 d后，指數(shù)生長(zhǎng)，倍增時(shí)間為4 d。

圖1 BMSCs的生長(zhǎng)觀察(×200)

2.2組織學(xué)觀察 股骨頭組織切片HE染色顯示，A組4 w時(shí)可見(jiàn)骨陷窩增加，骨小梁不規(guī)則、破壞。8 w時(shí)股骨頭軟骨面破壞與修復(fù)并存，軟骨面塌陷；B組8 w時(shí)在減壓邊緣形成少量的新生骨小梁；其余各組在4 w時(shí)缺損處內(nèi)有少量新生血管和類(lèi)骨細(xì)胞生成；8 w標(biāo)本減壓區(qū)D組中部分標(biāo)本可見(jiàn)血管形成，而C、E組缺少新生血管；F組8 w標(biāo)本壞死減壓區(qū)有大量新生血管及成骨細(xì)胞，可見(jiàn)骨小梁排列有序。見(jiàn)圖2。

2.3各組空骨陷窩數(shù)、血管計(jì)數(shù) F組4、8 w骨陷窩陽(yáng)性數(shù)與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血管數(shù)目數(shù)除與D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，與其余各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 8 w時(shí)股骨頭壞死區(qū)HE染色結(jié)果(×200)

組別空骨陷窩計(jì)數(shù)4 w8 w血管計(jì)數(shù)4 w8 wA組25.50±1.282)25.33±1.272)3.53±1.272)3.07±1.072)B組22.19±1.392)20.07±1.372)4.61±1.182)4.90±1.512)C組19.67±1.172)17.33±0.822)5.33±1.032)6.97±0.31D組14.33±1.031)2)8.13±0.822)7.98±1.291)9.53±0.531)E組13.24±1.231)2)9.47±1.312)5.07±1.312)6.50±1.05F組10.33±1.211)6.17±0.417.17±1.171)9.50±1.381)

與同組8 w比較：1)P<0.05；與F組比較：2)P<0.05

2.4壞死股骨頭X線(xiàn)檢查 A組4 w時(shí)股骨頭密度減低，骨小梁正常結(jié)構(gòu)消失；8 w時(shí)軟骨下骨破壞。B組減壓區(qū)術(shù)后4、8 w減壓區(qū)內(nèi)密度無(wú)明顯改變，剩下各組減壓區(qū)術(shù)后4 w時(shí)密度低，C、D、E組8 w時(shí)出現(xiàn)稀疏骨小梁，而8 w時(shí)F組可見(jiàn)較密的骨小梁。

3 討 論

對(duì)早期壞死股骨頭不治療，關(guān)節(jié)面就會(huì)塌陷，壞死的股骨頭與髖臼粘連，最終要進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換〔5〕。但髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后10～20年后需再次置換，因此需要找一種新的方法來(lái)治療股骨頭壞死，干細(xì)胞移植治療早期股骨頭壞死是近年研究中的熱點(diǎn)〔6〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在激素股骨頭壞死區(qū)有相對(duì)較多血管，有相關(guān)研究也證實(shí)VEGF可以促進(jìn)毛細(xì)血管長(zhǎng)入骨修復(fù)區(qū)，而VEGF不能直接促進(jìn)BMSCs生成血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而形成血管〔7〕。Zhang等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，髓芯減壓后，骨形成蛋白(BMP)和人VEGF通過(guò)腺相關(guān)病毒載體注入激素誘導(dǎo)兔早期ONFH病灶區(qū)，增強(qiáng)了壞死股骨頭的修復(fù)能力。有研究證實(shí)BMP和VEGF促進(jìn)BMSCs生成骨的能力比單獨(dú)BMP促進(jìn)BMSCs生成骨的能力強(qiáng)，因此可說(shuō)明VEGF可以促進(jìn)BMSCs生成骨細(xì)胞〔9〕，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

藻酸鈣支架具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)〔10〕，為BMSCs生成骨細(xì)胞修復(fù)壞死股骨頭區(qū)提供理想支架；能夠分泌鈣離子，從而促進(jìn)BMSCs生成骨細(xì)胞的能力，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。VEGF和藻酸鈣支架兩者都有促進(jìn)BMSCs生成骨細(xì)胞的作用，將會(huì)共同對(duì)早期股骨頭壞死區(qū)BMSCs起作用來(lái)生成新骨，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果F組股骨頭壞死區(qū)修復(fù)的最為理想。

自體BMSCs與VEGF結(jié)合藻酸鈣凝膠修復(fù)激素性股骨頭壞死療效可靠，VEGF不但促進(jìn)新生血管形成，而且加速骨的生長(zhǎng)，并且藻酸鈣支架釋放鈣離子促進(jìn)BMSCs的成骨，此治療方案可為治療早期股骨頭壞死提供理論基礎(chǔ)。