系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)肺動脈高壓兔的目征微循環(huán)改變

李倩雨 郭春燕 駱毅 李雪飛 吳銳

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

肺動脈高壓(PAH)是一種慢性進(jìn)展性疾病，其預(yù)后大多不良，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。根據(jù)病因，可以將PAH分為原發(fā)性和繼發(fā)性，而結(jié)締組織病相關(guān)性肺動脈高壓(CTD-PAH)是繼發(fā)性PAH中的一種，常見的包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)PAH、系統(tǒng)性硬化癥(SSc)相關(guān)PAH和混合性CTD相關(guān)PAH。研究顯示其中SSc-PAH是CTD-PAH中腦利鈉肽(BNP)水平最高、肺彌散功能最差、生存率最低的一組，SSc-PAH患者在未經(jīng)過治療的情況下，其平均生存時間為1年，與原發(fā)性PAH相比，其死亡風(fēng)險增加了3倍〔1～4〕。同時，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明改善PAH預(yù)后的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期治療〔5〕。目征微循環(huán)是基于中醫(yī)目診及目征微循環(huán)理論提出的一種血瘀證或血栓前狀態(tài)的定量診斷技術(shù)，主要觀察內(nèi)容為球結(jié)膜微血管改變，也是全身微循環(huán)的一部分。本研究旨通過觀察SSc-PAH兔模型的目征微循環(huán)變化特點，為其作為早期預(yù)測SSc-PAH的手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性新西蘭幼兔30只，體重1.5～2.0 kg，實驗動物由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，于實驗前1 w購入實驗動物，飼以兔飼料，自由攝入水分，監(jiān)測實驗動物的體重變化，實驗過程嚴(yán)格遵循單位及國家實驗動物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理 將實驗動物按體重隨機分為3組，每組10只，A組為溶劑對照組，采用無水乙醇與生理鹽水2∶8比例混合單次腹腔注射，B組為造模組，采用上述溶劑配成的博來霉素(1 mg/ml)100 μl/d及1.0%野百合堿溶液以50 mg/kg的劑量單次腹腔注射，C組為激素組，在造模同時每晨以甲潑尼龍3.27 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射。各組均飼養(yǎng)3 w造模3 w后觀察各組兔目征微循環(huán)變化。

1.2.2主要試劑與儀器 目征微循環(huán)儀加裝血瘀證目征軟件(徐州醫(yī)學(xué)光電公司)；電子天平(舜宇恒平儀器)；快速混勻器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；兔固定器(重慶渝科實驗耗材)；博來霉素(Invitrogen R250-01)；野百合堿(invitrogen)；甲潑尼龍(Pfizer制藥)。

1.2.3肺動脈壓力 造模3 w后，以10%的水合氯醛5 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后，取仰臥位固定于手術(shù)臺上，前正中切口，切開皮膚、皮下組織及肌肉組織，沿胸骨左側(cè)第7肋間剪開肌層，近胸骨處向上剪斷肋骨，取下胸骨，并在兩側(cè)縫線牽拉開，暴露心包，于肺主動脈干前壁插入測壓管，監(jiān)護(hù)儀可見肺動脈壓力波形，待波形穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)，以肺動脈壓力上升超過30 mmHg作為PAH造模成功。

1.2.4肺及肺動脈干、皮膚病理 待肺動脈壓力檢測完后，取下肺動脈干及右肺上葉組織，將其置于10%的甲醛溶液中固定，同時以注射博來霉素的部位為中心減去毛發(fā)，觀察皮膚的變化，在處死后剪下皮膚組織，同樣置于10%的甲醛溶液中固定，將肺動脈干、右肺上葉及皮膚脫水、石蠟包埋、 切片、HE染色以制作病理標(biāo)本。

1.2.5右室肥厚指數(shù)(RVHI) 取出心臟，減去左右心房，清理周圍血管及結(jié)締組織，沿室間隔邊緣剪下右心室游離壁，分離右心室(RV)、左心室(LV)加室間隔(IVS)，在生理鹽水中蕩滌殘留的血塊，清洗干凈后用濾紙吸干、稱重，并計算RVHI。

1.2.6目征微循環(huán)觀察方法及評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6.1觀察方法 于造模前、造模成功后第3周的分別對溶劑對照組、造模組和激素組進(jìn)行檢測，采用目征微循環(huán)儀器改裝成目征診斷儀(586 型號以上電腦，Windows XP 操作平臺、加裝視頻卡、 攝像頭和顯微鏡頭，安裝目征定量診斷軟件)。具體操作： 啟動目征診斷軟件，將兔的編號、分組、體重等信息輸入電腦后，將兔在清醒的狀態(tài)下固定于兔固定器內(nèi)，暴露雙耳及頭部，剪去雙眼的眼瞼睫毛，用眼科開瞼器將上下眼瞼撐開，充分暴露出球結(jié)膜血管，用高壓汞燈以45°的角度斜照于球結(jié)膜血管部，調(diào)整顯微鏡觀察目征微循環(huán)狀態(tài)，調(diào)節(jié)攝像頭，使電腦顯示器上同步出現(xiàn)其觀察圖像，并將圖像及資料錄入電腦，其分序號存檔，應(yīng)用目征微循環(huán)診斷法進(jìn)行診斷。

1.2.6.2評分標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)李國賢教授〔6〕提出的目征微循環(huán)診斷方法，根據(jù)血管扭曲條數(shù)、增粗條數(shù)、血管瘤、網(wǎng)狀畸形、新鮮出血、陳舊性出血、報傷點、血管色調(diào)，并結(jié)合眼周皮膚色調(diào)進(jìn)行積分判斷血瘀證及其輕重。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗及U秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肺動脈壓力 造模3 w后，存活兔25只，死亡5只，其中溶劑對照組1只，造模組2只，激素組2只。檢測各組肺動脈壓力平均值(mmHg)：溶劑對照組(15.89±2.02)，造模組(38.13±3.14)，激素組(24.5±4.4),3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且造模組均達(dá)到30 mmHg以上。

2.2肺及肺動脈干、皮膚病理 造模3 w后肺動脈干、右肺上葉、皮膚病理切片HE染色可見造模組與激素組肺動脈干的內(nèi)膜和中膜明顯較溶劑對照組增厚，其中以造模組增厚最為明顯；造模組與激素組的右肺上葉小動脈管壁較溶劑對照組也明顯增厚，管腔狹窄，并伴有肺組織的瘀血，且造模組的小動脈管壁厚度比激素組的增厚更加明顯，按照Rabinovitch等〔7〕對PAH進(jìn)行的病理分級，可以發(fā)現(xiàn)激素組的肺組織病理分級多在一期，而造模組多處于二、三期，見圖1。在皮膚病理方面，相較于溶劑對照組，造模組的皮膚真皮和皮下組織膠原纖維增生明顯，真皮層增厚，膠原腫脹、纖維化，彈性纖維破壞，表皮、皮膚附屬器及皮脂腺萎縮，汗腺減少。 造模組的病理符合SSC-PAH的表現(xiàn)，見圖1。

2.3RVHI 溶劑對照組為(0.253±0.008)，造模組為(0.377±0.006)，激素組為(0.311±0.027)，3組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4兔目征微循環(huán)改變

2.4.1兔目征微循環(huán)總計分改變 根據(jù)“目征微循環(huán)診斷方法”計算得出目征積分，造模3 w后，計算各組總積分值：溶劑對照組(1.67±2.50)分、造模組(11.25±5.18)分、激素組(5.63±3.20)分，3組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4.23組亞型目征微循環(huán)觀察指標(biāo)積分比較 在網(wǎng)狀畸形、血管瘤或血管怒張方面，造模組與溶劑對照對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而激素組與造模組、激素組與溶劑對照組間各亞型的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖1 各組肺組織皮膚組織病理結(jié)果(HE，×100)

組別n血管增粗血管扭曲報傷點網(wǎng)狀畸形出血血管瘤或血管怒張血管色調(diào)溶劑對照組91.11±2.200.56±1.670.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00造模組81.88±2.591.86±3.720.00±0.003.13±4.581)0.00±0.003.13±4.581)1.25±2.31激素組81.25±2.311.25±2.310.00±0.001.86±3.720.00±0.001.25±2.310.00±0.00

與溶劑對照組比較：1)P<0.05

2.4.33組亞型目征形態(tài)學(xué)改變 造模3 w后，造模組及激素組均可見微血管通透性增高，血管邊緣模糊。造模組還可見血管增粗、血管扭曲、網(wǎng)狀畸形、血管瘤及血管色調(diào)改變，激素組可見血管增粗、血管扭曲、網(wǎng)狀畸形及血管瘤樣改變(圖2)。

A、B、C為溶劑對照組：正常球結(jié)膜微血管形態(tài)，未見畸形、出血、擴張；D、E、F為激素組：D可見部分血管怒張，E可見部分血管增粗，F(xiàn)可見部分血管扭曲；G、H、I為造模組：G可見部分血管扭曲，H可見部分血管色調(diào)改變，I可見部分血管瘤樣改變圖2 各組亞型目征形態(tài)學(xué)改變

3 討 論

SSc是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，微血管內(nèi)皮細(xì)胞和小血管的纖維增生性病變是其發(fā)病機制之一〔8〕。PAH作為SSc最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生與SSc的微循環(huán)血管阻力增加有密切關(guān)系〔9〕。 2013年Valeria等〔10〕的研究發(fā)現(xiàn)在SSc的患者中甲襞微循環(huán)的評分高低與PAH的發(fā)生有關(guān)，強調(diào)了微循環(huán)的評估在SSc-PAH中的重要性。 目征微循環(huán)相較于甲襞微循環(huán)檢測更加不容易受外界環(huán)境影響，而且其可肉眼直接觀察進(jìn)行，方便快捷，屬于無創(chuàng)檢查。既往的研究已經(jīng)探討了高血壓、糖尿病、慢性乙肝肝炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡血栓前狀態(tài)與目征的關(guān)系〔11～14〕，發(fā)現(xiàn)目征可作為提示2型糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生的體征之一、高血壓控制達(dá)標(biāo)及預(yù)測靶器官損傷的指標(biāo)及判斷慢性乙型肝炎血瘀證輕重的有效方法。并且研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷是目征微循環(huán)異常改變的關(guān)鍵〔15,16〕，其主要機制是：血液流變的異常改變引起了組織缺氧缺血、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致一系列血管異常反應(yīng)，包括血管強烈收縮、血栓形成、血流瘀滯、血管擴張及血管壁通透性增強、微血管叢增多等，最終引起球結(jié)膜微血管形態(tài)及色調(diào)的改變，例如微血管扭曲、變形、增粗、瘤樣改變、滲出與出血、網(wǎng)狀畸形及色調(diào)變暗等。而CTD-PAH的病理生理特點主要包括：①當(dāng)原發(fā)病累及肺組織導(dǎo)致重度間質(zhì)性肺炎時，肺毛細(xì)血管床減少，超過70%時可以出現(xiàn)低氧血癥，引起肺循環(huán)阻力增加；②免疫炎性反應(yīng)導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物在血管內(nèi)沉積，導(dǎo)致肺血管炎，使得血管收縮、阻力增加；③內(nèi)皮系統(tǒng)受損導(dǎo)致內(nèi)皮素(ET)的合成或釋放增多，導(dǎo)致血管收縮、血栓形成；④血管重構(gòu)〔17,18〕。本實驗進(jìn)一步提示微循環(huán)改變與SSc-PAH的發(fā)病有關(guān)，且與SSc-PAH的疾病進(jìn)展程度呈正相關(guān)。