FTY720對他克莫司所致大鼠腎損傷的保護作用

張隆業(yè) 金吉哲 鄭海蘭 金健 樸尚國 李慧瑛 姜玉姬 金英順 李燦

(延邊大學附屬醫(yī)院腎病學科，吉林 延吉 133000)

長期使用他克莫司(TAC)可引起繼發(fā)性糖尿病和腎臟損傷，其中腎臟損傷表現(xiàn)為腎小管間質炎性細胞浸潤、纖維化及腎小管萎縮〔1〕。TAC所致腎損傷與激活的血管緊張素系統(tǒng)、炎性介質、致纖因子、一氧化氮及其酶失衡緊密相關〔2～4〕。研究表明免疫系統(tǒng)參與了組織修復和損傷過程。在缺血再灌注模型中，CD4/CD8敲除小鼠比C57BL/6對照組小鼠表現(xiàn)為較好的腎功能狀態(tài)〔5〕。另外，給予T細胞耗竭抗體顯著改善小鼠缺血再灌注所致腎功能和腎組織損傷，表明T淋巴細胞在組織損傷過程中扮演著重要角色〔6〕。本實驗利用動物模型探討淋巴細胞特異性抑制劑FTY720是否對TAC所致腎損傷具有保護作用。

1 材料和方法

1.1動物分組與藥物治療 雄性Sprague-Dawley大鼠 (Charles River，Technology，韓國) 體重220～240 g，在給予低鹽飼料(0.05% sodium，Teklad Premier，Madison，WI，USA) 1 w后隨機分成四組予以如下治療4 w：①正常對照組(n=6)：給予皮下注射橄欖油(1 ml·kg-1·d-1)；②FTY720組(VH+FTY，n=6)：給予橄欖油和灌胃FTY720(0.125 mg·kg-1·d-1)；③TAC組(n=8)：給予皮下注射TAC(1.5 mg·kg-1·d-1)；④TAC+FTY720組(n=8)：同時給予TAC和FTY720；4 w后處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標本以備進一步檢測。該動物實驗得到韓國加圖立大學動物倫理委員會批準 (CUMC-2017-0101-05)。

1.2生化檢測 定期測量各組大鼠的體重；尾壓法測定收縮期血壓(BP-2000，Visitech system，Apex，NC)；全自動生化分析儀測定血白細胞計數(shù)(ADVIA 120，日本拜耳公司)；標準酶比色法測定血肌酐(Scr)及血尿素氮(BUN)(Stanbio Laboratory,Boerne,TX,USA)；May-Grun-wald和Giemsa染色法計數(shù)淋巴細胞數(shù)；單克隆放射免疫法檢測全血TAC濃度(Incstar Co.，Stillwater，MN)。

1.3腎臟病理 腎臟組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蠟包埋后4 μm切片，行Masson三色染色，采用彩色圖像自動分析儀(Olympus，日本)高倍鏡視野下分析腎小管間質纖維化程度，每個標本至少觀察20個非重疊腎小管間質取平均值。

1.4免疫組織化學染色 步驟簡述如下：石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟，梯度酒精中脫水，37℃下 0.3%過氧化氫/甲醛30 min處理后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次。置微波爐中加熱行波爐抗原修復(98℃ 5 min)。室溫下非免疫性血清封閉液20 min。在4℃下滴加ED-1單克隆抗體(Serotec Inc.，UK)孵育12～16 h。PBS液洗3次后滴加二抗，室溫孵育2 h。以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物顯色，呈棕黃色為止。自來水流水洗滌，復染蘇木素，常規(guī)樹脂封片。CD3、CD8(Serotec，Raleigh，NC)、骨橋蛋白(OPN，MPIIIB10，Iowa，IA)的染色步驟同前。染色程度用數(shù)字化顯微鏡分析儀(Olympus，日本)，Polygon 程序算出每0.5 mm2染色數(shù)。

1.5Western印跡法 腎組織利用蛋白質裂解液制成勻漿，常溫下離心取上清液測定蛋白濃度(Bio-Rad，Hercules)，20 μg的標本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉膜2 h后，4℃下置轉化生長因子(TGF)-β1抗體(Santa Cruz公司，USA)于非脂牛乳中以1∶1 000濃度孵育12～16 h，室溫下緩沖液洗滌3次，加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG(Amersham)1 h，室溫下緩沖液洗滌3次增強發(fā)光(ECLTM，Amersham)和曝光。以對照組為標準(100%)測定條帶密度，以β-actin(Sigma，USA)校正。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1FTY720 對基本數(shù)據(jù)及腎功能的影響 TAC 組大鼠表現(xiàn)為體重下降、腎功能惡化(Scr和BUN的上升)；FTY720雖然對體重下降無影響，但可以明顯改善腎功能；各組間收縮期血壓無顯著性差異；FTY720治療減少TAC所致全血白細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)的升高。見表1。

2.2FTY720對各組腎組織中T淋巴細胞的作用 在正常腎組織中很少檢測到CD3和CD8陽性細胞數(shù)。然而在TAC組大鼠腎小管間質中可觀察到大量的CD3和CD8陽性細胞(圖1和圖2)，給予FTY720治療明顯減少TAC 所致CD3和CD8陽性細胞浸潤(均P<0.05)。見表2。

表1 各組基本數(shù)據(jù)及腎功能比較

ND：未檢測；與正常對照組比較：1)P<0.05;與TAC組比較：2)P<0.05，下表同

圖1 各組腎組織CD3陽性細胞(DAB，×400)

2.3FTY720對炎癥反應的作用 正常腎小管間質偶見OPN蛋白的表達和ED-1陽性細胞，而TAC組腎組織中可以見到較強的OPN和ED-1的免疫反應性，其主要位于受損的腎小管和間質(圖3和圖4)；與TAC組相比，F(xiàn)TY720治療削弱OPN和ED-1的免疫反應性。以上結果提示，F(xiàn)TY720對TAC所致腎損傷具有抗炎作用。見表2。

圖2 各組腎組織CD8陽性細胞(DAB，×400)

圖3 各組腎組織ED-1陽性表達(DAB，×400)

圖4 各組腎組織OPN陽性表達(DAB，×400)

組別nCD3陽性細胞(個/0.5 mm2)CD8陽性細胞(個/0.5 mm2)ED-1陽性細胞(個/0.5 mm2)OPN陽性細胞表達(%/0.5 mm2)TIF(%/0.5 mm2)TGF-β1/β-actin(%)正常對照組67.2±2.44.1±2.97.8±2.15.2±1.10.3±0.1100.0±2.5FTY720 組65.6±2.73.9±1.65.9±1.54.9±0.90.5±0.1105.3±4.7TAC組821.3±4.11)17.2±2.41)42.8±7.31)30.1±3.11)17.9±2.61)890.5±45.81)TAC+FTY720組813.8±2.81)2)10.2±2.11)2)28.7±5.31)2)16.3±2.81)2)12.5±2.31)2)573.7±40.21)2)

2.4FTY720對腎小管間質纖維化的作用 圖5示在TAC組中可見到典型的腎小管間質纖維化形成，同時給予大鼠FTY720明顯改善腎小管間質纖維化。TAC組TGF-β1蛋白的表達上調；FTY720顯著下調TGF-β1蛋白的表達，見圖6，提示FTY720對TAC所致腎損傷具有抗纖維化作用。見表2。

圖5 各組腎小管間質纖維化Masson染色(×400)

1～4:正常對照組、FTY720組、TAC組、TAC+FTY720組圖6 各組腎組織TGF-β1表達

3 討 論

本研究結果表明入侵的T淋巴細胞在TAC誘導的腎損傷中起著重要角色，而 FTY720是有效的治療手段之一。據(jù)報道在慢性自身免疫性腦脊髓炎中，F(xiàn)TY720抑制巨噬細胞聚集〔7〕；另外，F(xiàn)TY720 改善抗TY-1抗體所致腎小球硬化模型的腎小管間質纖維化〔8〕，提示FTY720具有保護作用。本實驗中，F(xiàn)TY720減少TAC所致腎小管間質炎性反應和纖維化形成。在分子水平上，F(xiàn)TY720治療明顯下調炎性介質OPN的表達，繼之減少巨噬細胞浸潤。此外，F(xiàn)TY720下調TGF-β1蛋白的表達，防止腎小管間質纖維化。本實驗結果與Rausch等〔7〕及Peters等〔8〕對 FTY720 具有抗炎抗纖維化作用的報道相一致。然而，這種作用是否與減少的T淋巴細胞有關尚不清楚，可能與以下幾點有關：第一，TAC誘導大量的淋巴細胞浸潤，并與巨噬細胞相互作用共同參與了炎性反應〔9〕；第二，入侵的淋巴細胞局部釋放一定數(shù)量的炎性介質和促纖維化生長因子，其中包括TGF-β1，其可直接增強纖維化形成〔10〕；第三，激活的腎內血管緊張素系統(tǒng)參與了T淋巴細胞所介導的腎損傷，因為直接注射血管緊張素(Ang)Ⅱ引起腎臟大量T淋巴細胞的浸潤，然而阻斷AngⅡ該效應則消失〔11〕。本研究表明T淋巴細胞介導TAC誘導的腎損傷，但異型抗原非依賴的組織損傷如TAC腎病是否激活T淋巴細胞還不清楚。我們曾報道過TAC或環(huán)孢素(Cs)A誘導的腎毒性活化Toll樣受體、產生內源性Toll樣受體配體、熱休克蛋白70，并引起樹突細胞成熟，它是T淋巴細胞激活所必備的因素之一〔12〕。因此，TAC所致腎損傷有可能激活固有免疫和T淋巴細胞，扮演清道夫角色，促進組織修復，類似的結果亦可在缺血再灌注模型中觀察到〔13〕，說明激活的T淋巴細胞起到兩種截然不同功能，在特定的環(huán)境下參與組織器官的損傷或修復。因此，非免疫性因素也可引起免疫反應，T淋巴細胞有可能在固有免疫和獲得免疫中起到橋梁作用。

FTY720 是一類特異性淋巴細胞抑制劑，但它還具有T淋巴細胞-非依賴效應，如增加內皮屏障功能、保持血管完整性、抗纖維化等〔14〕，其腎臟保護作用在缺血再灌注〔15〕、高血壓腎損模型〔16〕、5/6腎切除模型〔17〕中相繼被報道。因此，使用T淋巴細胞抗體或CD3/CD8基因敲除動物觀察是否可減輕各種腎臟損傷有待于進一步探討。任何一種藥物都有益處和不良反應，為避免毒副作用的發(fā)生劑量選擇顯得尤為重要。以往研究表明，F(xiàn)TY720在0.05～10.00 mg·kg-1·d-1劑量范圍下對同種異體移植的諸多模型具有強有力的免疫抑制作用〔18〕。本實驗選擇FTY720(0.125 mg·kg-1·d-1)劑量不僅減少了TAC所致腎損傷，而且對血TAC濃度沒有影響，與臨床上患者使用后血藥濃度極相近(0.25～3.50 mg)。總之，低劑量FTY720能有效地減少TAC相關的腎損傷、改善腎功能、防止排斥事件發(fā)生，具有腎臟保護作用。