中藥塌漬對膝骨關(guān)節(jié)炎兔MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc表達(dá)的影響

唐芳 馬武開 盧向陽 肖麗娜 周靜 徐暉

(貴陽中醫(yī)學(xué)院 1第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，貴州 貴陽 550001；2研究生院)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)橹鞯穆约膊?，主要由關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及關(guān)節(jié)周圍肌肉損傷和骨質(zhì)增生為特征，臨床主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動受限，該病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)研究表明其與年齡、性別和體重等密切相關(guān)〔1，2〕。目前臨床上對KOA的治療方法，主要以改善關(guān)節(jié)癥狀，延緩關(guān)節(jié)退變程度為主，嚴(yán)重者采取膝關(guān)節(jié)置換術(shù)。中藥塌漬療法作為我國傳統(tǒng)的中醫(yī)外治方法，早已廣泛應(yīng)用于臨床，且已被證實(shí)治療KOA有效〔3，4〕。最新研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與KOA發(fā)病密切相關(guān)，其下游基因的表達(dá)水平與KOA關(guān)節(jié)軟骨退變程度有直接相關(guān)性〔5〕。據(jù)此我們在前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證中藥塌漬療法治療KOA是否與其影響Wnt/β-catenin信號通路下游基因表達(dá)水平相關(guān)。為驗(yàn)證該假說，我們通過建立兔KOA模型，探討不同溫度的中藥塌漬療法對KOA模型兔關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、cylinD1、c-myc表達(dá)水平的影響。

1 材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及條件 健康新西蘭兔72只，雌雄各半(分籠飼養(yǎng))，體重(2.05±0.51)kg，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2012-0001。喂養(yǎng)飼料來源：貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。實(shí)驗(yàn)兔均進(jìn)行1 w的適應(yīng)期喂養(yǎng)，然后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑及藥品 TRIzol總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司，批號：DP405-02)、50 bp DNA Laddder(Solarbio，貨號：M1800)、PrimeScriptTMRT試驗(yàn)盒(TaKaRa，批號：RR047B)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa，批號：RR82LR)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa，批號：3427Q)、雙氯芬酸二乙胺乳膠劑(扶他林，北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字號：H19990291)、中藥溻漬療法中藥(活血通痹湯：方由透骨香、黑骨藤、海桐皮、透骨草、川芎、防風(fēng)、白芷、乳香、沒藥、紅花、當(dāng)歸、大血藤等藥組成)，由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.3儀器 渦旋振蕩儀(QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、離心機(jī) (Centrifuge 5415D，Eppendorf)、熒光定量PCR儀(ABI7500，Applied Biosystems)、分光光度計(NANODROP 2000，Thermo scientific)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 1600，上海天能科技有限公司)、-80℃冰箱(DW-HL388、中科美菱)。

1.4動物模型制作 采用隨機(jī)數(shù)字表法將新西蘭兔隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為空白組、模型組、扶他林組、42℃中藥塌漬治療組、37℃中藥塌漬治療組、32℃中藥塌漬治療組。適應(yīng)期喂養(yǎng)結(jié)束后，采用石膏管型固定法〔6〕用管型石膏和小鋁板將兔膝關(guān)節(jié)固定在伸直位，限制膝關(guān)節(jié)活動，制作兔KOA模型，造模時間為4 w。第5周起3個中藥塌漬組(42℃、37℃、32℃)將提前準(zhǔn)備好的中藥用恒溫鍋維持相應(yīng)的溫度恒定不變，將紗布裁剪合適大小后放入中藥中浸泡后擰至藥液不滴出，敷于兔造模膝關(guān)節(jié)上，每5 min更換1次紗布以維持塌漬溫度，每次塌漬20 min，每天1次；扶他林組是每次擠出約20 mg扶他林軟膏均勻涂擦于造模膝關(guān)節(jié)，并輕輕揉搓2～4 min；空白組和模型組正常飼養(yǎng)，給藥時間4 w。

1.5關(guān)節(jié)軟骨病理觀察 外治干預(yù)治療4 w后采取空氣栓塞法處死動物，先解剖造模膝關(guān)節(jié)，肉眼大體觀察關(guān)節(jié)軟骨表面，然后取各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨制作標(biāo)本。經(jīng)中性甲醛固定，硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，由專人觀察各組標(biāo)本病理。軟骨病理改變參考Mankin進(jìn)行評分〔7〕。

1.6RT-PCR法檢測MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達(dá)水平 引物由北京Invitrogen公司合成，見表1。

表1 目的基因引物序列

將軟骨組織盡量剪碎充分裂解后，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，具體按TRIzol總RNA提取試劑說明書進(jìn)行。提取的RNA使用NanoDrop?ND-2000測定濃度和純度，cDNA產(chǎn)物在20 μl體系中進(jìn)行，設(shè)定反應(yīng)條件，取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，自動凝膠成像分析儀分析。用Bandscan4.0軟件進(jìn)行灰度掃描。用總灰度表示各條帶mRNA表達(dá)量，比較各泳道目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參的灰度比，作為各目的條帶mRNA的相對含量。取3次獨(dú)立電泳的灰度比，計算平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1關(guān)節(jié)表面大體觀察 空白組可見關(guān)節(jié)表面光滑，有光澤富有彈性，未見裂痕，關(guān)節(jié)未見明顯腫脹、增生和滑膜充血；模型組可見關(guān)節(jié)面粗糙不平整，色澤暗淡，軟骨較薄伴有糜爛，關(guān)節(jié)明顯腫脹和明顯增生、滑膜充血；治療組關(guān)節(jié)表面情況均好于模型組但差于空白組，治療組組內(nèi)比較，42℃中藥塌漬組關(guān)節(jié)表面較光滑，輕度關(guān)節(jié)腫脹和滑膜充血，較其他治療組稍好，而37℃中藥塌漬組、扶他林組、32℃中藥塌漬組均可見關(guān)節(jié)表面不平整，伴有關(guān)節(jié)腫脹和滑膜充血，肉眼觀察差異性不明顯。

2.2病理結(jié)果

2.2.1病理圖片 光鏡下可見空白組軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，分布均勻，排列整齊，潮線完整；模型組軟骨較薄，表面粗糙，伴有列缺，細(xì)胞數(shù)目較少，排列紊亂，局部聚集明顯，染色不明顯，潮線模糊；治療組在軟骨表面光滑程度、細(xì)胞數(shù)目、分布、染色情況及潮線均好于模型組差于空白組，治療組組內(nèi)比較，42℃中藥塌漬組鏡下軟骨表面較光滑，細(xì)胞數(shù)目較多，分布較均勻，可染色，潮線模糊但有層次，較其他治療組稍好，而37℃中藥塌漬組、扶他林組、32℃中藥塌漬組可見較少的細(xì)胞數(shù)量，分布比較亂，有局部細(xì)胞積聚，潮線較模糊，見圖1。

圖1 各組部分病理圖片結(jié)果(HE，×200)

2.2.2Mankin評分結(jié)果 模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin評分〔(11.00±0.82)分〕與空白組〔(1.50±0.50)分〕比較明顯升高(P<0.01)；治療組Mankin評分均明顯低于模型組(P<0.01)，高于空白組(P<0.05)；治療組組內(nèi)比較Mankin評分從低到高依次是42℃中藥塌漬組〔(3.00±0.82)分〕、37℃中藥塌漬組〔(4.75±0.83)分〕、扶他林組〔(5.75±0.82)分〕、32℃中藥塌漬組〔(7.50±1.12)分〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3不同組軟骨組織MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達(dá)水平比較 模型組MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達(dá)量均最高，空白組均最低，模型組與空白組有顯著差異(P<0.01)；治療組其 mRNA的表達(dá)量均低于模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組內(nèi)比較，42℃中藥塌漬組MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達(dá)量均最低，其次從低到高依次是37℃中藥塌漬組、扶他林組、32℃中藥塌漬組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同組MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達(dá)量

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；治療組組內(nèi)比較：3)P<0.05

3 討 論

KOA形成的主要原因是膝關(guān)節(jié)軟骨降解、骨贅形成和軟骨損傷等，為了研究其形成的具體機(jī)制，人們發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與KOA的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系〔8，9〕。而Wnt/β-catenin信號通路的作用途徑是當(dāng)該信號通路被激活時，通過抑制降解復(fù)合物減少β-catenin的降解，使積累的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)該信號通路下游基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化和凋亡〔10〕。所以Wnt/β-catenin信號通路對KOA的調(diào)控主要取決于其下游基因的表達(dá)，主要有MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc。

MMPs一種由結(jié)締組織細(xì)胞分泌并參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原、蛋白多肽等〔11〕。而KOA的主要是由于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解所致，所以MMPs在KOA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔12〕。李保馳等〔13〕通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMPs蛋白與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且OA患者滑膜中表達(dá)明顯高于非OA患者。BMPs是一種生長因子，其可通過調(diào)節(jié)蛋白多糖的合成在軟骨保護(hù)和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，其中BMP-2是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號分子之一。有研究表明BMPs在早期誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)基質(zhì)合成，促進(jìn)軟骨形成同時也參與了軟骨細(xì)胞的終末分化過程致使軟骨退化，促進(jìn)OA形成〔14〕。詹宏鋼等〔15〕在研究獨(dú)活寄生湯對KOA的作用機(jī)制使發(fā)現(xiàn)活寄生湯可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因BMP-2轉(zhuǎn)錄，可保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，緩解關(guān)節(jié)疼痛。cyclinD1是細(xì)胞周期含量呈周期性變化的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展過程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，所以其在正常細(xì)胞中處于低水平狀態(tài)〔16〕。結(jié)合其同為Wnt/β-catenin信號通路下游基因，其很有可能與軟骨細(xì)胞的增值、分化有很大關(guān)系。c-myc是一種轉(zhuǎn)錄因子，其可調(diào)控cyclinD1、cyclinE及p27等細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長，c-myc的過度表達(dá)使細(xì)胞擺脫細(xì)胞周期的限制，導(dǎo)致細(xì)胞惡化，進(jìn)入過度增殖的狀態(tài)。其不僅與腫瘤細(xì)胞生長增殖與分化相關(guān)，也有軟骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡相關(guān)〔17〕。

本實(shí)驗(yàn)表明Wnt/β-catenin信號通路下游基因與KOA的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，中藥塌漬法治療KOA療效明確，且適宜溫度的中藥溻漬法治療效果更佳。而中藥塌漬療法很有可能就是通過調(diào)控該信號通路，下調(diào)下游基因MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達(dá)治療KOA。