功能植物內(nèi)生細(xì)菌篩選及對(duì)多環(huán)芳烴降解效能研究

陶佳雨，洪亞軍，陳雪梅，劉文韜，朱雪竹，苗雅慧

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類(lèi)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)，以直鏈狀、角狀或串狀方式構(gòu)成的有機(jī)化合物，是有機(jī)物不完全燃燒或高溫裂解的副產(chǎn)品[1-2]。土壤作為一種重要的環(huán)境介質(zhì)，承擔(dān)著90%以上的PAHs環(huán)境負(fù)荷。由于PAHs均存在于表層土壤中，且具有高脂溶性和低水溶性，使其比較容易分配到生物體內(nèi)，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，從而對(duì)人體健康和整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的安全構(gòu)成很大危害[3-4]。因此，如何降低土壤和植物PAHs污染一直備受關(guān)注。

近年來(lái)，利用具有PAHs降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌與植物來(lái)聯(lián)合修復(fù)PAHs污染土壤并降低植物PAHs污染已成為土壤環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。植物內(nèi)生細(xì)菌是能定殖在健康植物組織內(nèi)，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類(lèi)微生物，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗逆性和降低植物病蟲(chóng)害發(fā)生等生理生態(tài)功能[5-6]。陳小兵等[7]從長(zhǎng)期受石油污染土壤上生長(zhǎng)的植物體內(nèi)分離篩選出具有菲降解功能的內(nèi)生細(xì)菌7J2，經(jīng)抗藥性標(biāo)記后能較好地定殖于小麥體內(nèi)，并能促進(jìn)小麥生長(zhǎng)，更能提高小麥對(duì)土壤中菲的去除率。SUN等[8]從PAHs污染區(qū)植物體內(nèi)分離篩選出具有芘降解功能的內(nèi)生細(xì)菌BJ06，抗性標(biāo)記后能有效定殖于黑麥草體內(nèi)，并能提高黑麥草對(duì)土壤中芘的去除率，降低植物PAHs污染風(fēng)險(xiǎn)。

以PAHs中典型代表芘為目標(biāo)污染物，采用平板直接分離法從PAHs污染區(qū)的鐵莧菜(Acalyphaaustralis)、香附子(Cyperusrotundus)和麥冬(Ophiopogonjaponicus)體內(nèi)分離篩選具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌，并探索不同環(huán)境條件對(duì)其生長(zhǎng)及芘降解效能的影響，從而為研究PAHs降解機(jī)制和修復(fù)PAHs污染環(huán)境提供理論依據(jù)和微生物資源。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

萘、芴、菲、芘、熒蒽和苯并[a]芘均購(gòu)于德國(guó)Fluka公司，純度w≥98%，其基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1[9]。甲醇為高效液相色譜純，其余化學(xué)試劑均為分析純。

表1萘、芴、菲、芘、熒蒽和苯并[a]芘6種PAHs的基本性質(zhì)[9]

Table1SelectedphysicalandchemicalpropertiesofPAHsinthisstudy

名稱(chēng)環(huán)數(shù)分子式 相對(duì)分子質(zhì)量溶解度/(mg·L-1)lg Kow萘(NAP)2C10H8128.1831.003.30芴(FLU)3C13H10166.221.904.18菲(PHE)3C14H10178.231.154.46芘(PYR)4C16H10202.260.1324.88熒蒽(FLA)4C16H10202.250.265.16苯并[a]芘(BaP)5C20H12252.320.001 66.13

Kow為辛醇-水分配系數(shù)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：ρ(蛋白胨)10.00 g·L-1，ρ(酵母粉)5.00 g·L-1，ρ(NaCl)10.00 g·L-1，pH值7.0。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：ρ[(NH4)2SO4]1.50 g·L-1，ρ(K2HPO4·3H2O)1.91 g·L-1，ρ(KH2PO4)0.50 g·L-1，ρ(NaCl)0.50 g·L-1，ρ(MgSO4·7H2O)0.20 g·L-1，微量元素溶液2 mL，pH值7.0。其中微量元素溶液成分：ρ(CoCl2·6H2O)0.100 g·L-1，ρ(MnCl2·4H2O)0.425 g·L-1，ρ(ZnCl2)0.050 g·L-1，ρ(NiCl2·6H2O)0.010 g·L-1，ρ(CuSO4·5H2O)0.015 g·L-1，ρ(Na2MoO4·2H2O)0.010 g·L-1，ρ(Na2SeO4·2H2O)0.010 g·L-1。

PAH降解培養(yǎng)基：將10 mg·mL-1PAH丙酮溶液過(guò)0.22 μm孔徑濾膜除菌后，取一定量置于滅菌的三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完，加入已滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，使PAH濃度達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度。

固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，使其w為1.8%～2%。

滅菌條件：121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 功能菌株的分離篩選

從南京某石化企業(yè)芳烴廠(chǎng)排污口附近采集健康的鐵莧菜、香附子和麥冬進(jìn)行芘降解功能植物內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選。植物樣品用去離子水將表面清洗干凈，無(wú)菌條件下依次用φ為75%乙醇漂洗3～5 min，無(wú)菌水沖洗3～4次，φ為0.1%次氯酸鈉漂洗2～5 min，然后用無(wú)菌水沖洗至確保植物表面消毒劑去除。將表面滅菌的植物樣品移入LB培養(yǎng)基固體平板上，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)72 h，檢查植物表面滅菌是否徹底[10]。取1 g表面滅菌完全的植物樣品，用10 mL無(wú)菌水在滅菌研缽中充分研磨。勻漿液靜置20 min后，取適量上清液稀釋涂布于芘降解培養(yǎng)基固體平板上，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3～7 d。挑取不同形態(tài)生長(zhǎng)良好的單菌落劃線(xiàn)純化獲得純菌株，鑒定其對(duì)芘降解效能。

1.4 功能菌株的鑒定

采用透射電子顯微鏡觀(guān)察功能內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)并進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)[11]。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取菌株的基因組DNA，并以其為模板采用PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因。16S rRNA基因擴(kuò)增的正向引物和反向引物分別為16S rRNA-27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S rRNA-1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Premix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，重蒸水10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：(1)預(yù)變性：94 ℃，4 min；變性：94 ℃，30 s；退火：55 ℃，30 s；(2)延伸：72 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)；(3)終極延伸：72 ℃，10 min；(4)保溫：10 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，由南京金斯瑞生物技術(shù)公司進(jìn)行純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用BLAST軟件(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，并采用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 菌懸液的制備

將功能菌接種到LB培養(yǎng)基中，并在LB培養(yǎng)基中加入芘丙酮溶液(丙酮φ<0.5‰)，使ρ(芘)=50 mg·L-1。在30 ℃條件下以150 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h后，以6 000 r·min-1(相對(duì)離心力RCF為519)離心10 min，棄掉上清液。收集的菌體加入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基沖洗混勻后再次離心收集菌體。洗滌過(guò)程重復(fù)2～3次以充分去除菌體表面殘留的LB培養(yǎng)基。清洗好的功能菌用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基制成菌懸液，利用比濁法調(diào)整接種濃度至D600為1.0〔單位體積菌落數(shù)(以CFU計(jì)，下同)約為8.77〕。

1.6 功能菌株的降解特性

1.6.1菌株芘降解效能的測(cè)定

在20 mL芘降解培養(yǎng)基中加入菌懸液，使φ(菌懸液)為5%，初始功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值約為7.45，30 ℃條件下以150 r·min-1搖床避光培養(yǎng)10 d后取樣測(cè)定培養(yǎng)液中功能菌數(shù)量和芘殘留濃度[12]。

1.6.2菌株降解廣譜性的測(cè)定

選擇萘、芴、菲、熒蒽、芘和苯并[a]芘為PAHs代表，研究功能菌對(duì)2、3、4和5環(huán)PAHs的降解效能。在20 mL PAH降解培養(yǎng)基中加入菌懸液，使φ(菌懸液)為5%，初始功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值約為7.45，萘、芴、菲、熒蒽、芘和苯并[a]芘質(zhì)量濃度分別為500、100、50、50、50和10 mg·L-1。30 ℃條件下以150 r·min-1搖床避光培養(yǎng)7 d后取樣測(cè)定培養(yǎng)液中萘、芴和菲殘留濃度，10 d后取樣測(cè)定培養(yǎng)液中芘、熒蒽和苯并[a]芘殘留濃度。

1.6.3菌株的降解條件優(yōu)化

通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中功能菌數(shù)量和芘殘留濃度來(lái)探究pH、溫度、鹽濃度、裝液量、接種量、芘濃度和外加碳源對(duì)功能菌芘降解效能的影響。配制pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的芘降解培養(yǎng)基，研究pH值對(duì)功能菌芘降解效能的影響。設(shè)置搖床溫度分別為15、20、25、30、35、40和45 ℃，研究溫度對(duì)功能菌芘降解效能的影響。配制NaCl添加量分別為0、5、10、15、20、25、30和35 g·L-1的芘降解培養(yǎng)基，研究鹽濃度對(duì)功能菌芘降解效能的影響。配制100 mL三角瓶中裝液量分別為10、20、30、40、50、60和70 mL的芘降解培養(yǎng)基，研究裝液量對(duì)功能菌芘降解效能的影響。向芘降解培養(yǎng)基中加入菌懸液，使φ(菌懸液)分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%和17%，初始功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值分別約為6.77、7.23、7.45、7.59、7.69、7.77和7.83，研究接種量對(duì)功能菌芘降解效能的影響。配制ρ(芘)分別為25、50、75、100、125和150 mg·L-1的芘降解培養(yǎng)基，研究功能菌對(duì)不同濃度芘的降解效能。配制葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度分別為100 mg·L-1的芘降解培養(yǎng)基，對(duì)照CK不加糖，研究外加碳源對(duì)功能菌芘降解效能的影響。配制ρ(葡萄糖)分別為0、10、50、100、200 mg·L-1的芘降解培養(yǎng)基，研究不同濃度葡萄糖對(duì)功能菌芘降解效能的影響。

除裝液量影響試驗(yàn)中設(shè)置裝液量為70 mL的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光靜置培養(yǎng)外，其他試驗(yàn)均以150 r·min-1搖床避光培養(yǎng)10 d。除溫度影響試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)培養(yǎng)溫度均為30 ℃；除裝液量影響試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)裝液量均為20 mL；除功能菌接種量影響試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)接種量φ均為5%，使功能菌初始數(shù)對(duì)數(shù)值約為7.45；除芘初始濃度影響試驗(yàn)，其他試驗(yàn)ρ(芘)均為50 mg·L-1。

1.6.4菌株降解曲線(xiàn)的測(cè)定

在10 mL含100 mg·L-1葡萄糖的芘降解培養(yǎng)基(50 mg·L-1)中加入菌懸液，使φ(菌懸液)為5%，30 ℃條件下以150 r·min-1搖床避光培養(yǎng)21 d，CK不加菌。每24 h整瓶取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中功能菌數(shù)量、芘濃度和降解中間產(chǎn)物(1-羥基-2-萘甲酸，1H2N)濃度。

1.6.5測(cè)定方法

培養(yǎng)液中功能菌數(shù)量測(cè)定：采用固體平板計(jì)數(shù)法，取培養(yǎng)液稀釋涂布于芘降解培養(yǎng)基固體平板上，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板計(jì)數(shù)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算1 mL培養(yǎng)液含菌量。

培養(yǎng)液中PAHs濃度測(cè)定：采用整瓶提取法[12]，向培養(yǎng)液中加入等體積甲醇，超聲混勻，靜置后過(guò)0.22 μm孔徑濾膜。采用高效液相色譜儀(LC-20AT)測(cè)定PAHs濃度。高效液相色譜儀設(shè)定參數(shù)：Inertsil ODS-SP-C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，進(jìn)樣量20 μL。各污染物出峰時(shí)間：萘：4.7 min；芴：5.3 min；菲：5.4 min；芘：6.1 min；熒蒽：5.9 min；苯并[a]芘：7.8 min。

培養(yǎng)液中芘和降解中間產(chǎn)物濃度同時(shí)測(cè)定：采用整瓶提取法[12]，向培養(yǎng)液中加入等體積甲醇，超聲混勻，靜置后過(guò)0.22 μm孔徑濾膜。用高效液相色譜儀測(cè)定芘與中間產(chǎn)物濃度。高效液相色譜儀設(shè)定參數(shù)：Inertsil ODS-SP-C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相甲醇：水(含甲酸φ=0.1%)；梯度洗脫，0～12.50 min；φ為100%甲醇，12.50～19 min；φ為70%甲醇，19～27 min；φ為30%甲醇；柱溫40 ℃；流速0.80 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；進(jìn)樣量20 μL。1H2N和芘的出峰時(shí)間分別為12.4和17.0 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能菌株的分離與鑒定

通過(guò)分離、培養(yǎng)和純化獲得的8株功能菌，均可在含50 mg·L-1芘降解培養(yǎng)基固體平板上形成直徑大于2 mm的菌落，10 d的芘降解率見(jiàn)表2。從麥冬體內(nèi)分離獲得的菌株P(guān)Rd5在共代謝基質(zhì)存在與缺失條件下均具有最高的芘降解效能，且關(guān)于腸桿菌屬(植物體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬)降解PAHs的研究報(bào)道不多，所以選其研究植物內(nèi)生細(xì)菌PAHs降解效能。

菌株P(guān)Rd5在LB培養(yǎng)基固體平板上培養(yǎng)2 d時(shí)，菌落直徑1～3 mm，呈圓形、光滑、隆起、乳白色、有光澤、邊緣整齊狀態(tài)(圖1)。在透射電鏡下，菌株P(guān)Rd5聚集成團(tuán)，周身鞭毛，球桿狀，大小為(0.6～0.9) μm ×(0.8～1.2) μm(圖1)。生理生化特性見(jiàn)表3。

表2法國(guó)功能菌對(duì)芘的降解效能

Table2Biodegradationofpyrenebyfunctionalendophyticbacteria

菌株編號(hào)GenBank登錄號(hào)寄生植物所屬種屬DPYR/%DPYRG/%PRd1KY203966鐵莧菜(Acalypha australis)Rhizobium sp.22.55±0.9828.05±0.90PRd2KY203967鐵莧菜(Acalypha australis)Sphingopyxis sp.22.09±1.1032.06±1.45PRd3KY203968香附子(Cyperus rotundus)Burkholderia sp.10.01±1.3234.25±1.49PRd4KY203969香附子(Cyperus rotundus)Ralstonia sp.7.59±4.3045.21±1.03PRd5KY203970麥冬(Ophiopogon japonicus)Enterobacter sp.45.50±3.1364.97±4.63PRd6KY203971麥冬(Ophiopogon japonicus)Xanthomonas sp.34.09±2.7344.82±5.58PRd7KY203972麥冬(Ophiopogon japonicus)Chitinophaga sp.35.16±2.2386.42±1.48PRd8KY203973麥冬(Ophiopogon japonicus)Methylobacterium sp.10.64±2.5042.16±2.07

DPYR為以芘為唯一碳源的降解率；DPYRG為以芘和葡萄糖為共同碳源的降解率。

×7.0 K Z00m-1 HC-1 80 KV

表3Enterobactersp.PRd5的生理生化特性

Table3ThemorphologicalandbiochemicalcharacteristicsofEnterobactersp.PRd5

生理生化特征菌株P(guān)Rd5生理生化特征菌株P(guān)Rd5革蘭染色-葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)+芽孢染色-硝酸鹽還原試驗(yàn)+尿素酶試驗(yàn)+吲哚試驗(yàn)-氧化酶試驗(yàn)-產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)+過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)+檸檬酸鹽利用+甲基紅試驗(yàn)-明膠液化試驗(yàn)+V-P試驗(yàn)+淀粉水解試驗(yàn)-

“-”表示陰性反應(yīng)，“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)。

通過(guò)Genebank進(jìn)行BLAST比對(duì)表明，菌株P(guān)Rd5與EnterobacterludwigiiEN-119(JTLO01000001)和LeclerciaadecarboxylataGTC 1267(AB273740)的相似度最高(99.5%)，其基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。綜合菌株P(guān)Rd5的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性分析，將其鑒定并命名為Enterobactersp. PRd5。目前，已有多株腸桿菌降解PAHs的報(bào)道。GUPTA等[13]從原油污染土壤中分離出1株具有萘降解功能的腸桿菌F3，7 d對(duì)萘(100 mg·L-1)的降解率為61.11%。SHENG等[10]從生長(zhǎng)于石油冶煉廠(chǎng)的薤白莖內(nèi)分離出1株具有芘降解功能的腸桿菌12J1，7 d對(duì)芘(5 mg·L-1)的降解率為83.8%。

圖2 Enterobacter sp. PRd5基于16S rRNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 功能菌株的降解廣譜性

Enterobactersp. PRd5對(duì)多種單一PAH的降解效能見(jiàn)圖3。

圖3 Enterobacter sp. PRd5對(duì)單一PAH的降解效能

菌株P(guān)Rd5 7 d對(duì)初始質(zhì)量濃度為500、100和50 mg·L-1的萘、芴和菲的降解率分別為99.96%、96.65%和95.48%；菌株P(guān)Rd5 10 d對(duì)初始質(zhì)量濃度為50、50和10 mg·L-1的芘、熒蒽和苯并[a]芘的降解率分別為49.95%、35.89%和17.44%。這表明菌株P(guān)Rd5不僅可高效降解2～3環(huán)的低分子量PAHs(LMW-PAHs)，同時(shí)可降解4～5環(huán)的高分子量PAHs(HMW-PAHs)。

2.3 功能菌株的降解條件優(yōu)化

環(huán)境條件可改變Enterobactersp. PRd5的生長(zhǎng)及芘降解效能(圖4)。菌株P(guān)Rd5生長(zhǎng)的最適pH值為7，此時(shí)的功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值和芘降解率均達(dá)到最大值，分別為8.11和49.63%。當(dāng)pH值<6或>9時(shí)，菌株P(guān)Rd5的降解率隨酸性或堿性程度的增加而降低(圖4)。研究表明，菌株P(guān)Rd5降解芘的最適溫度為30 ℃，此時(shí)功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值和芘降解率分別為8.03和49.75%。當(dāng)溫度<30 ℃時(shí)功能菌數(shù)量和芘降解率均隨溫度升高而增加；而當(dāng)溫度>30 ℃時(shí)，其均隨著溫度的升高而降低(圖4)。培養(yǎng)基中額外的NaCl抑制了菌株P(guān)Rd5的生長(zhǎng)與芘降解，功能菌的生長(zhǎng)和芘降解效能隨NaCl添加量的增加均降低，未添加NaCl處理的功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到8.08，芘降解率達(dá)50.63%(圖4)。隨培養(yǎng)基體積的增加，菌株P(guān)Rd5的生長(zhǎng)受到抑制，芘降解率降低，表明其為好氧菌。100 mL的三角瓶中培養(yǎng)基體積為10 mL時(shí)，菌株P(guān)Rd5生長(zhǎng)最好，功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值為8.66，芘降解率可達(dá)58.92%(圖4)。接種量為1%～9%時(shí)，功能菌數(shù)量和芘降解率隨接種量的增加而明顯增加；而當(dāng)接種量>9%時(shí)，功能菌數(shù)量的增長(zhǎng)有所減緩(圖4)。當(dāng)初始ρ(芘)<50 mg·L-1時(shí)，功能菌數(shù)量和芘降解效能隨芘濃度升高而增加；而當(dāng)初始ρ(芘)>50 mg·L-1時(shí)，功能菌數(shù)量和芘降解率則隨濃度升高而下降。這表明高濃度芘對(duì)菌株P(guān)Rd5具有較強(qiáng)的抑制作用(圖4)。外加碳源可以增強(qiáng)菌株P(guān)Rd5降解芘的效能，促進(jìn)芘降解的能力強(qiáng)弱依次為葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蔗糖和CK(圖4)。外加不同濃度葡萄糖的研究結(jié)果表明，當(dāng)ρ(葡萄糖)為100 mg·L-1時(shí)，菌株P(guān)Rd5芘降解效能提高最多(圖4)。

n為單位體積菌落數(shù)(以CFU計(jì))。圖4 環(huán)境條件對(duì)Enterobacter sp. PRd5生長(zhǎng)和降解芘的影響

研究表明，微生物代謝PAHs的方式主要有兩種：一是以L(fǎng)MW-PAHs為唯一碳源和能源進(jìn)行單一代謝；另一種是HMW-PAHs與其他有機(jī)質(zhì)發(fā)生共代謝(co-metabolism)[14]。共代謝作用通過(guò)改變微生物碳源與能源的底物結(jié)構(gòu)來(lái)擴(kuò)大微生物對(duì)碳源和能源的選擇范圍，并激活降解酶活性，從而提高微生物降解PAHs的效能，達(dá)到難降解物質(zhì)最終被微生物降解利用的目的[15-16]。郝大程等[17]研究表明，投加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以刺激有毒難降解有機(jī)物的生物降解。筆者將葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖這5種外加碳源作為共代謝底物，研究其對(duì)菌株P(guān)Rd5降解芘的影響，結(jié)果表明不同的外加碳源均促進(jìn)了菌株P(guān)Rd5的生長(zhǎng)和對(duì)芘的降解，其中葡萄糖的效果最佳，與王萬(wàn)清[18]研究結(jié)果一致。葡萄糖作為共代謝底物具有來(lái)源廣泛、無(wú)毒害、與芘無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)ρ(葡萄糖)為100 mg·L-1時(shí)，菌株P(guān)Rd5對(duì)芘的降解率可高達(dá)64.97%～80.22%，當(dāng)ρ(葡萄糖)>100 mg·L-1時(shí)，菌株P(guān)Rd5對(duì)芘降解率降低，表明葡萄糖濃度過(guò)高，微生物會(huì)大量利用葡萄糖而使芘降解效能減弱，此與張杰等[19]研究結(jié)果相似。

2.4 功能菌株的降解曲線(xiàn)

圖5為Enterobactersp. PRd5的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和降解動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，菌株P(guān)Rd5在ρ(葡萄糖)為100 mg·L-1的芘降解培養(yǎng)基(50 mg·L-1)中生長(zhǎng)良好。功能菌數(shù)量與芘去除量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。培養(yǎng)的前4 d，功能菌數(shù)量增加迅速，降解速率為4.052 mg·L-1·d-1(R2=0.947)；培養(yǎng)的后4 d，受各種降解中間產(chǎn)物的影響，功能菌數(shù)量增幅開(kāi)始減小，菌株P(guān)Rd5降解芘的速度減緩，降解速率為3.517 mg·L-1·d-1(R2=0.995)。這可能是因?yàn)槠咸烟窃诔跗诖龠M(jìn)了功能菌的生長(zhǎng)，從而提高了芘去除。培養(yǎng)16 d后，功能菌數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到最大值，為8.52，此時(shí)菌株P(guān)Rd5對(duì)芘降解率達(dá)到99%。培養(yǎng)17 d后，功能菌數(shù)量逐漸減小，降解中間產(chǎn)物1H2N不斷增加，菌株P(guān)Rd5的生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。該結(jié)果與已有的研究報(bào)道相似。TIAN等[20]研究假單胞菌(Pseudomonas)CGMCC 1.766在20、50、100、200 mg·L-1的菲降解培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，1H2N的積累能達(dá)到19.3(36 h)、43.3(32 h)、73.4(40 h)和144.4(48 h)mg·L-1，分別是理論值的93.4%、85.7%、70.3%和68.2%。MACCHI等[21]研究鞘脂菌(Sphingomonas)20006FA降解840 mg·L-1菲時(shí)發(fā)現(xiàn)，161 h的降解率能達(dá)到49.1%，同時(shí)1H2N積累量達(dá)到166 mg·L-1。由此可見(jiàn)，由于培養(yǎng)基中基質(zhì)的消耗、菌株P(guān)Rd5的生長(zhǎng)和本身生理機(jī)理等原因造成中間產(chǎn)物的積累[20]。在芘轉(zhuǎn)化為1H2N的上游降解途徑中，編碼第一步環(huán)羥基化反應(yīng)所需的起始雙加氧酶被認(rèn)為是PAHs降解的最關(guān)鍵功能基因[22-24]。通過(guò)對(duì)菌株P(guān)Rd5進(jìn)行全基因組測(cè)序來(lái)挖掘其起始雙加氧酶基因，但測(cè)序所獲得的編碼雙加氧酶的基因均非特征性PAHs起始雙加氧酶基因，可能是因?yàn)殡p加氧酶基因恰好位于測(cè)序缺口上，而以精細(xì)圖呈現(xiàn)的測(cè)序結(jié)果并沒(méi)有對(duì)缺口區(qū)域的基因進(jìn)行補(bǔ)缺，也可能是PAHs起始雙加氧酶基因位于菌株P(guān)Rd5的質(zhì)粒上，而DNA提取方法不當(dāng)導(dǎo)致提取過(guò)程中質(zhì)粒濃度過(guò)低或丟失。后續(xù)會(huì)通過(guò)提取菌株質(zhì)粒，再采用菌株覆蓋度高的引物進(jìn)行PCR或進(jìn)行質(zhì)粒全基因組測(cè)序以獲得對(duì)應(yīng)的起始雙加氧酶基因。若仍不能成功獲得對(duì)應(yīng)的起始雙加氧酶基因，表明該基因位于染色體上，會(huì)進(jìn)一步從雙加氧酶引物篩選和PCR條件優(yōu)化兩方面設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

n為單位體積菌落數(shù)(以CFU計(jì))。圖5 Enterobacter sp. PRd5培養(yǎng)液中芘、1H2N濃度和生物量隨時(shí)間的變化

3 結(jié)論

(1)從PAHs污染區(qū)生長(zhǎng)良好的植物體內(nèi)分離篩選出多株對(duì)芘具有耐受性和降解性的菌株，從中挑選出1株降解性能最佳的菌株作為研究對(duì)象。菌株P(guān)Rd5分離自麥冬體內(nèi)，根據(jù)其培養(yǎng)特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性分析結(jié)果，將其命名其為Enterobactersp. PRd5。

(2)菌株P(guān)Rd5在30 ℃條件下以150 r·min-1搖床避光培養(yǎng)10 d后，對(duì)芘(50 mg·L-1)的降解率為41.37%～50.63%，并且對(duì)萘、芴和菲等LMW-PAHs具有較高的降解效能，對(duì)熒蒽和苯并[a]芘等LMW-PAHs也有一定的降解效能。菌株P(guān)Rd5降解芘的優(yōu)化條件：pH值為6.0～8.0，溫度為25～35 ℃，外加鹽濃度為0～10 g·L-1，100 mL三角瓶中裝液量為10～30 mL，細(xì)菌接種量為3%～17%，初始ρ(芘)為25～50 mg·L-1，外加碳源為葡萄糖(ρ=100 mg·L-1)。