側(cè)腦室注射鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)能力及行為學(xué)的影響

李善華，周利，張霞，何華瓊

阿爾茨海默病 (AD) 即老年性癡呆，是老年人常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱匿、進(jìn)行性腦功能衰退性神經(jīng)疾病。AD病人具有持續(xù)進(jìn)行性的智能衰退的特點(diǎn)，其認(rèn)知和記憶功能進(jìn)行性下降，臨床出現(xiàn)智力衰退、進(jìn)行性癡呆并最終導(dǎo)致人格及性格完全改變，嚴(yán)重者生活不能自理，需要長(zhǎng)期照顧，增加家庭負(fù)擔(dān)并嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量[1]。臨床研究表明，鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mNGF)具有促進(jìn)受損中樞神經(jīng)元生長(zhǎng)分化作用，對(duì)受損中樞和外周神經(jīng)元均有營(yíng)養(yǎng)作用，可通過加速損傷神經(jīng)纖維及軸索的再生來(lái)促進(jìn)損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)[2-3]。鑒于mNGF在臨床應(yīng)用治療AD已取得了一定的療效，但其缺乏相關(guān)的動(dòng)物研究，特別是電生理結(jié)合學(xué)習(xí)記憶能力方面的研究，本實(shí)驗(yàn)于2017年5—8月通過側(cè)腦室注射mNGF，采用膜片鉗記錄技術(shù)和國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的行為學(xué)檢測(cè)方法來(lái)觀察和研究其治療AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠作用，分析作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠20只(C57BL/6J)，老年正常C57BL/6J小鼠10只，均為雄性，體質(zhì)量(20.0±1.0)g，周齡為7周。動(dòng)物基線資料如性別、體質(zhì)量和周齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。動(dòng)物均購(gòu)自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司 [許可證SYXK(鄂)2017-0031]。將20只老年癡呆轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6J)采用隨機(jī)數(shù)字表法分為AD組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，另取10只老年正常C57BL/6J小鼠設(shè)為老年組作為對(duì)照。遵偱3R原則(替代、減少、優(yōu)化)，實(shí)驗(yàn)過程中充分保證動(dòng)物福利、給予動(dòng)物人道關(guān)懷。動(dòng)物自由飲水并飼以顆粒飼料，動(dòng)物房12 h交替光照，相對(duì)濕度保持在75%左右，恒溫(22～24)℃。動(dòng)物處置也符合倫理學(xué)原則。

1.2儀器與試劑Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)WMT-100(成都泰盟軟件有限公司，型號(hào)：WMT-100)；鼠腦立體定位儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；玻璃電極拉制儀(日本 Narishige 公司，型號(hào)：PP-83)；膜片鉗放大器 (英國(guó) Campden 公司，型號(hào)：Mul-ticlam p700A )，振動(dòng)切片機(jī)(英國(guó)Campden公司，型號(hào)：752M)；注射用mNGF(廈門北小之路生物工程有限公司,批號(hào):017082408)；小鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 和神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司)。

1.3給藥方法將實(shí)驗(yàn)組小鼠麻醉后固定于小鼠立體定位儀，用微量注射器將20 μL 注射用mNGF準(zhǔn)確注射于側(cè)腦室內(nèi)，間隔10 d注射一次，共注射3次。老年組注射等量0.9%氯化鈉注射液作為對(duì)照，治療同實(shí)驗(yàn)組。

1.4海馬回腦薄片的制備及全細(xì)胞膜片鉗記錄方法參照文獻(xiàn)[4]，先將人工腦脊液通95%O2+5%CO2飽和并放入冰箱(4 ℃)備用。小鼠用斷頭器斷頭，咬骨頭鉗去頂骨，迅速分離出小腦組織，置于 4 ℃ 95%O2+5%CO2飽和人工腦脊液中浸泡5 min，修整海馬回區(qū)域，用振動(dòng)切片機(jī)切成約300～400 μm厚度的海馬回腦薄片。然后在人工腦脊液中用針頭分離出海馬回CA1區(qū)，再孵育 1 h備用。參照文獻(xiàn)[5]，用Mul-ticlam p700A 膜片鉗放大器進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄海馬CA1區(qū)群峰電位(PS)和自發(fā)性動(dòng)作電位 (AP)，記錄的PS和AP采用Pclamp軟件分析。記錄前先用PP-83 控制儀拉制玻璃微電極( 直徑約1～2 μm )，微電極用pH為7.2標(biāo)準(zhǔn)電極內(nèi)液充灌30 min，灌前用0.22 μm濾膜過濾后，使充灌后的微電極內(nèi)封接電阻為 2～6 MΩ。海馬CA1區(qū)全細(xì)胞膜片鉗記錄在20～25 ℃的室溫下進(jìn)行，記錄時(shí)將備用海馬回CA1區(qū)腦薄片移入浴槽中，用恒流泵持續(xù)灌注95%O2+5%CO2混合人工腦脊液，然后推進(jìn)微電極，使微電極尖端與細(xì)胞膜形成巨阻抗，封接成功后抽吸破膜(負(fù)壓破膜使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通)即可形成全細(xì)胞記錄。

1.5BDNF和NGF蛋白檢測(cè)參照文獻(xiàn)[6]，取給藥前后分離好的海馬回CA1區(qū)腦薄片，采用免疫組化法檢測(cè)腦薄片蛋白陽(yáng)性表達(dá)。先將標(biāo)本石蠟包埋后切片、烤干、脫蠟，滴一抗(BDNF)，4 ℃ 過夜，陰性對(duì)照滴加磷酸緩沖鹽(PBS)溶液。隔日后室溫下復(fù)溫，滴二抗工作液，37 ℃孵育10 min，辣根酶標(biāo)記 10 min；用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，然后分化、返藍(lán)、脫水、封片。高倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)。腦薄片SP染色后BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性為胞漿棕黃色或黃褐色。用圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)各組平均光密度 (MOD)值。

1.6實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 取分離好的海馬回CA1區(qū)腦薄片，一步法提取腦薄片總RNA，取1μg總RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)BDNF和NGF mRNA表達(dá)。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：93 ℃ 30 s、94 ℃ 3 min、64 ℃ 30s、71 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，71 ℃ 7 min。以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比表示BDNF和NGF mRNA的相對(duì)值[7]。

表1 引物序列表

1.7Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)在鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子側(cè)腦室注射前和第40天進(jìn)行 Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)，測(cè)試時(shí)隨機(jī)選取四個(gè)象限中的任意一點(diǎn)，將小鼠頭向上，面向池壁放入水中，記錄小鼠 60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)，用空間探索實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察大鼠運(yùn)行軌跡來(lái)評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力(評(píng)估4次取均值)[8]。

2 結(jié)果

2.1mNGF對(duì)小鼠腦薄片海馬回CA1區(qū)BDNF、NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)的影響老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區(qū)BDNF、NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯變化。治療前，AD組和實(shí)驗(yàn)組小鼠BDNF、NGF均低于老年組(P<0.05)。治療第40天，AD組低于老年組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)則明顯升高，與AD組和治療前同組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)見表 2。

2.2mNGF對(duì)小鼠腦薄片海馬回CA1區(qū)BDNFmRNA、NGFmRNA表達(dá)的影響老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區(qū)BDNF mRNA、NGF mRNA無(wú)明顯改變。AD組和實(shí)驗(yàn)組小鼠治療前后BDNF mRNA、NGF mRNA均低于老年組(P<0.05)。治療第40天，實(shí)驗(yàn)組BDNF mRNA、NGF mRNA表達(dá)明顯提高，與AD組和治療前同組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)見表3。

2.3mNGF對(duì)小鼠全細(xì)胞膜片鉗記錄海馬CA1區(qū)PS和AP結(jié)果的影響老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區(qū)PS和AP膜電位保持在正常水平，且治療前后無(wú)明顯改變。AD組小鼠治療前后PS和AP膜電位均高于老年組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠治療前PS和AP膜電位高于老年組(P<0.05)，治療第40天，PS和AP膜電位降低，與AD組和治療前同組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)見表4。

表2 小鼠治療前后BDNF、NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

表3 小鼠治療前后BDNF mRNA、NGF mRNA 表達(dá)比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

表4 小鼠治療前后海馬CA1區(qū)PS和AP膜電位比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

表5 小鼠治療前后空間探索穿臺(tái)次數(shù)和定位航行逃避潛伏期比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

2.4mNGF對(duì)小鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果的影響在定位航行試驗(yàn)中，老年組治療第40天游泳次數(shù)和逃避潛伏期與治療前同組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療前，AD組和實(shí)驗(yàn)組的逃避潛伏期均較老年組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。但治療第40天，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期較AD組明顯縮短，與AD組和治療前同組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在空間探索試驗(yàn)中，各組在撤去平臺(tái)60 s后，AD組和實(shí)驗(yàn)組治療前小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療第40天，實(shí)驗(yàn)組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯高于AD型組(P<0.05)，老年組運(yùn)動(dòng)軌跡主要在原平臺(tái)位置，AD組則主要分散在外周，而實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)軌跡在兩者之間。具體數(shù)據(jù)見表5。

3 討論

mNGF是從大鼠頜下腺提取的一類蛋白質(zhì)，研究表明，mNGF可改善丙烯胺和己二酮致小鼠中毒性周圍神經(jīng)病肢體運(yùn)動(dòng)障礙，可提高受損神經(jīng)—肌肉動(dòng)作電位幅度、縮短動(dòng)作電位潛伏期，對(duì)中毒性周圍神經(jīng)病具有保護(hù)作用，可促進(jìn)損傷神經(jīng)功能恢復(fù)[9]。本實(shí)驗(yàn)通過側(cè)腦室直接注射mNGF，減少影響吸收各環(huán)節(jié)，觀察其對(duì)AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及行為學(xué)的影響，分析可能機(jī)制。

在本實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠分3次(間隔10 d)側(cè)腦室注射mNGF進(jìn)行干預(yù)性治療，AD組和老年組同時(shí)間點(diǎn)注射等量0.9%氯化鈉注射液對(duì)照。在治療前和治療第40天用Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)進(jìn)行定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)；采用全細(xì)胞膜片鉗記錄海馬CA1區(qū)誘發(fā)的PS和AP膜電位；采用免疫組化法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)腦組織BDNF和NGF及其基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組以上各指標(biāo)均優(yōu)于AD組，提示側(cè)腦室直接注射mNGF可改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，主要通過遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)發(fā)揮對(duì)神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生作用，對(duì)感覺神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、交感神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等均具有促進(jìn)存活及保護(hù)作用[10-11]。BDNF廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中的一類蛋白質(zhì)，尤以海馬區(qū)含量最為豐富，BDNF對(duì)正常神經(jīng)元的分化、發(fā)育、成熟及受損神經(jīng)元的修復(fù)均有促進(jìn)作用，而大腦海馬區(qū)與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)[12-13]。因此，研究mNGF對(duì)NGF和BDNF有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦薄片海馬回CA1區(qū)BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)及BDNF mRNA、NGF mRNA明顯升高，提示側(cè)腦室直接注射mNGF可顯著地調(diào)控海馬回CA1區(qū)中的BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)及BDNF mRNA、NGF mRNA的表達(dá)，保護(hù)及修復(fù)受損的神經(jīng)元細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區(qū)PS和AP電位保持在相對(duì)正常水平，且治療前后無(wú)明顯改變。AD組小鼠治療前后PS和AP膜電位均高于老年組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠治療前PS和AP膜電位高于老年組(P<0.05)，治療第40天，PS和AP膜電位降低，與AD組和治療前同組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在持續(xù)性退化性損傷，AD組小鼠腦薄片海馬回CA1區(qū)PS和AP膜電位高于對(duì)照的老年組，這可能是多巴胺能神經(jīng)元或膽堿能神經(jīng)元損傷造成膜電位升高。當(dāng)側(cè)腦室直接注射mNGF后，mNGF可能發(fā)揮了抗膽堿酯酶作用，使神經(jīng)元突觸Ach恢復(fù)至正常水平，受損神經(jīng)元異常升高的膜電位得以恢復(fù)，從而減輕異常膜電位對(duì)神經(jīng)元持續(xù)性或傷害性刺激，使受損的神經(jīng)元得以修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯高于AD型組，但低于老年組，老年組運(yùn)動(dòng)軌跡主要在原平臺(tái)位置，AD組則主要分散在外周，而實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)軌跡在兩者之間。這說(shuō)明海馬回CA1區(qū)BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)及BDNF mRNA、NGF mRNA高表達(dá)可改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和行為學(xué)，而mNGF可促進(jìn)其合成、營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)受損神經(jīng)元[14]。

綜上所述，mNGF能促進(jìn)AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這對(duì)改善其行為學(xué)起到促進(jìn)作用。其作用機(jī)制可能與調(diào)控海馬回CA1區(qū)中的BDNF和NGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)及BDNF mRNA、NGF mRNA的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí)，mNGF也可能通過影響膽堿能神經(jīng)突觸釋放神經(jīng)遞質(zhì)Ach，抑制異常膜電位來(lái)減輕神經(jīng)功能損傷和退化，促進(jìn)AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦能量的代謝，修復(fù)和營(yíng)養(yǎng)受損中樞神經(jīng)來(lái)改善AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能。