蛋白質(zhì)糖基化接枝改性研究進展

馮燕英 牟代臣 祁文磊 陳茂龍 許 宙 程云輝

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院, 湖南 長沙 410000)

食品蛋白質(zhì)不僅是最重要的營養(yǎng)成分，還可在不同的加工條件下改變食品的外觀、滋味和質(zhì)構(gòu)。然而，食品蛋白質(zhì)的工業(yè)應(yīng)用往往受限于極端加工條件下的不穩(wěn)定性，如加熱、剪切等處理；而難以同時具備多種功能特性，也是導(dǎo)致不少天然蛋白質(zhì)無法滿足更多食品加工要求的主要原因[1]。因此，通過合適的改性技術(shù)來拓展天然蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重要意義[2]。

蛋白質(zhì)的改性是通過修飾其結(jié)構(gòu)，改變其理化性質(zhì)，進而達到改善其功能性質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)改性常用的方法有物理改性[3-4]、化學(xué)改性[1,5]和酶法改性[6]等。大多數(shù)化學(xué)改性方法因使用了對人體健康有害的試劑而無法應(yīng)用于食品行業(yè)[7]；物理改性的效果主要取決于機械力，且改性效果大多不明顯；而酶法改性主要受限于酶的成本以及蛋白質(zhì)水解所產(chǎn)生的苦味。深度開發(fā)綠色、高效、安全的改性方法一直是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的熱點。

蛋白質(zhì)的糖基化改性是基于美拉德反應(yīng)機理的羰氨縮合反應(yīng)，該過程不需任何化學(xué)催化劑參與，通過自發(fā)的美拉德反應(yīng)即可使蛋白質(zhì)分子的ε-氨基與糖分子的還原性末端羰基進行共價結(jié)合而實現(xiàn)[1]，所得到的蛋白質(zhì)—糖共價復(fù)合物?？勺鳛樾再|(zhì)優(yōu)良的多功能添加劑，因其反應(yīng)條件溫和、安全性高而倍受矚目。但因難以控制美拉德反應(yīng)進程，限制了其工業(yè)化、規(guī)?；瘧?yīng)用；同時，蛋白質(zhì)糖基化分子修飾的反應(yīng)機制和糖基化產(chǎn)物構(gòu)效關(guān)系的研究尚未明了。

本文擬綜述近年來國內(nèi)外蛋白質(zhì)糖基化接枝改性機理及其反應(yīng)進程中標志物篩選的研究進展，并對接枝方法進行分析比較，介紹美拉德反應(yīng)改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的研究現(xiàn)狀，以期為蛋白質(zhì)糖基化改性提供理論參考。

1 蛋白質(zhì)糖基化改性的反應(yīng)機制與進程

1.1 蛋白質(zhì)糖基化改性的反應(yīng)機制

糖基化改性由蛋白質(zhì)、肽或氨基酸側(cè)鏈上的游離氨基與還原糖分子末端的羰基縮合引發(fā)，形成席夫堿并重排為Amadori或Heyns產(chǎn)物[8]。美拉德反應(yīng)一般分為3個階段[1]，在初始階段，蛋白質(zhì)氨基與還原性羰氨發(fā)生縮合反應(yīng)，形成N-糖胺并釋放一分子水形成Schiff 堿，進一步環(huán)化為N-取代糖基胺，再經(jīng) Amadori 重排生成Amadori產(chǎn)物，即1-氨基-1-脫氧-酮糖。賴氨酸殘基的ε-氨基反應(yīng)活性最高，此外來自氨基酸的末端胺基團、組氨酸殘基的咪唑基、色氨酸殘基的吲哚基以及精氨酸殘基的胍基也發(fā)生不同程度的反應(yīng)。在中間階段，始于Amadori產(chǎn)物或Heyns產(chǎn)物的降解，可以通過氧化、斷裂、烯醇化、脫水、酸水解和自由基反應(yīng)而改變，生成多種化合物。其中，Amadori產(chǎn)物的降解取決于體系環(huán)境，如pH、時間和溫度等。在酸性條件下，初始階段形成的氨基酮糖或氨基醛糖經(jīng)1,2-烯醇化生成各種羰基化合物，如羰甲基呋喃醛、麥芽酚、異麥芽酚和還原酮等化合物；在堿性條件下，Amadori產(chǎn)物的降解主要涉及2,3-烯醇化，形成還原酮類，如4-羥基-5-甲基-2,3-二氫呋喃-3-酮以及各種裂變產(chǎn)物，包括縮醛、丙酮醛和丁二酮。這些化合物具有高反應(yīng)活性，可進一步經(jīng)strecker降解反應(yīng)生成醛類、吡嗪及褐色色素[9]。在高級階段，多羰基不飽和衍生物繼續(xù)進行裂解反應(yīng)，形成揮發(fā)性化合物；同時還進行醇醛縮合、聚合反應(yīng)，形成棕色共聚物，統(tǒng)稱為類黑素[10]。

1.2 蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)進程

糖基化反應(yīng)對食品的色澤、風(fēng)味具有重要意義，但也可能帶來負作用，如乳制品的褐變。同時，糖基化反應(yīng)高級階段形成的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，可能在諸如糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等慢性疾病的發(fā)病機理中起著重要作用[9]。將糖基化反應(yīng)進程各階段形成的特征化合物作為標志物來監(jiān)測與控制反應(yīng)進程的意義不言而喻。

通?？蓪?94，420 nm處的吸光度值分別作為監(jiān)測蛋白質(zhì)—糖美拉德反應(yīng)中間體的產(chǎn)生(如還原酮、醛類)[11-13]及褐變程度的指標[14-16]。Yu等[13]在研究酸性氨基酸-L抗壞血酸反應(yīng)進程時，發(fā)現(xiàn)在120～150 ℃反應(yīng)10～120 min的條件下，延長反應(yīng)時間、升高反應(yīng)溫度皆會導(dǎo)致294 nm處吸光度值隨之增加，通過擬合420 nm處吸光度值，發(fā)現(xiàn)150 ℃時反應(yīng)速率常數(shù)比120 ℃高出10倍。Sheng等[17]采用A294 nm作為考察指標優(yōu)化了溶菌酶—普魯蘭多糖的改性條件，研究結(jié)果表明在糖質(zhì)比8：1、pH 7.5、60 ℃條件下反應(yīng)5 d，接枝產(chǎn)物溶解度可由61.73% 提高至 81.61%。

α-二羰基化合物(丙酮醛、乙二醛)、5-羥甲基糠醛(HMF)和還原酮都是美拉德反應(yīng)的活性中間體[10]，可作為美拉德反應(yīng)的標志物[18]。Han等[18]研究了棕色發(fā)酵乳的加工和儲藏過程，結(jié)果表明脫脂奶粉與葡萄糖在95 ℃ 反應(yīng)180 min時，3-脫氧葡糖醛酮濃度高達(82.13±0.64) mg/L，高出丙酮醛20倍，HMF濃度在60～180 min加工時間內(nèi)也從(0.16±0.03) mg/L提高至(0.53±0.02) mg/L。此外，在乳制品[1]、肉制品[19]加工領(lǐng)域，也常將糠氨酸作為美拉德反應(yīng)的標志物。

AGEs也是美拉德反應(yīng)進程的重要標志物，如羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)[10]。Oh等[20]研究發(fā)現(xiàn)在酪蛋白和葡萄糖、半乳糖美拉德反應(yīng)過程中，CML含量隨加熱溫度提高和時間延長而增大，在加熱時間為114.8/117.9 min、溫度為145.1/148.8 ℃時，CML生成量達最大值，分別為12.0/14.0 μg/mL。Courel等[21]研究發(fā)現(xiàn)曲奇中AGEs的形成與加熱時間存在相關(guān)性，但與加熱溫度呈非線性相關(guān)，因而可通過工藝條件優(yōu)化來減少AGEs的生成。

美拉德反應(yīng)的中間與高級階段十分復(fù)雜，反應(yīng)機理目前尚不明了，這些階段產(chǎn)生的部分化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)仍有待確定，利用美拉德反應(yīng)特征化合物監(jiān)測跟蹤反應(yīng)進程還需要更深入地開展研究。

2 蛋白質(zhì)糖基化改性方法

糖基化改性方法主要有干熱法和濕熱法。干熱法反應(yīng)時需控制體系水分活度在較低狀態(tài)，以使蛋白質(zhì)的氨基處于非聚集或少聚集的狀態(tài)，但反應(yīng)時間往往長達幾天至幾周。濕熱法的反應(yīng)速度雖有所提高，但在傳統(tǒng)水溶液體系中，蛋白質(zhì)—糖接枝反應(yīng)效率一直受到反應(yīng)溫度和反應(yīng)物濃度的制約，但反應(yīng)溫度和反應(yīng)物濃度的提高又將導(dǎo)致蛋白質(zhì)更易發(fā)生變性或形成更多聚集[22]。

2.1 干熱法

干熱法是一種基于固相體系的反應(yīng)方法，首先由日本Kato教授[23]提出，將蛋白質(zhì)和糖均勻分散于緩沖溶液中，然后進行冷凍干燥，通常在50～60 ℃和一定的相對濕度范圍內(nèi)進行美拉德反應(yīng)，降溫即可終止反應(yīng)的進行。

目前已報道的通過糖基化干熱法改性的蛋白質(zhì)有乳清蛋白[24-25]、酪蛋白[26]、大豆分離蛋白[27]、β-伴大豆球蛋白[28]、小麥蛋白[29]、米渣蛋白[30]等。雖然該法所制備的接枝產(chǎn)物功能特性較好，但反應(yīng)耗時長，且反應(yīng)條件較為嚴格，這使干熱法的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用受到了很大限制。

2.2 濕熱法

濕熱法一般是將蛋白質(zhì)與糖的混合溶液在高溫加熱的條件下進行，主要步驟與干熱法相同，先將蛋白質(zhì)和糖分散于緩沖溶液中，再置于水浴或油浴中加熱，最后利用冰浴終止反應(yīng)。

Meng等[31]分別采用干熱、濕熱法制備酪蛋白—葡聚糖接枝物，發(fā)現(xiàn)濕熱法制備的接枝物粒徑大小是干熱產(chǎn)物的1.32倍，且對姜黃素具有較好的包埋能力。Yue等[32]研究了大米蛋白水解產(chǎn)物與糖類(單糖、寡糖、多糖)的濕法接枝改性，發(fā)現(xiàn)接枝產(chǎn)物的功能性質(zhì)得到大大改善，溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性分別提高了3.5，5.3，7.3倍。

2.3 其他改性方法

傳統(tǒng)濕熱法改性蛋白質(zhì)因反應(yīng)時間較長、能耗較高也難以實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外對接枝方法的改進大多聚焦于其他輔助手段與濕熱法的結(jié)合，如利用超聲波[33-34]、微波[35-36]、高壓[37]等作為輔助手段。

Wang等[38]利用超聲波輔助濕熱法進行了綠豆分離蛋白和葡萄糖的接枝改性，發(fā)現(xiàn)在300 W超聲輔助加熱20 min條件下，接枝產(chǎn)物的接枝度、溶解度、乳化活性均取得最大值。Farzaneh等[35]采用微波輔助濕熱與傳統(tǒng)濕熱法對牛血清白蛋白和麥芽糊精進行糖基化改性，發(fā)現(xiàn)微波輔助制備接枝產(chǎn)物的接枝度由傳統(tǒng)濕熱法的29%提高至33%，溶解度從0.745 mg/mL提高至1.105 mg/mL。

目前大量研究報道集中在采用干熱法、濕熱法以及其他技術(shù)手段輔助傳統(tǒng)濕熱法改性蛋白質(zhì)的工藝條件探索上，鮮少有加熱類型對接枝物理化性質(zhì)影響的報道，不同改性方法反應(yīng)機制之間差異性的揭示也很少涉及。

3 糖基化改性對蛋白質(zhì)功能特性的影響

糖基化改性賦予了接枝產(chǎn)物不同于未改性蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，已報道的功能特性改善包括溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性、熱穩(wěn)定性和抗氧化、抗菌等活性。

3.1 溶解性

通過糖基化接枝反應(yīng)改善蛋白質(zhì)的溶解性是基于糖分子的引入可以增加親水基團的數(shù)量，并增強蛋白質(zhì)的空間穩(wěn)定性[25,39]。同時，親水性多糖無規(guī)則線團結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的屏蔽效應(yīng)也能減弱蛋白質(zhì)聚集的趨勢[40]。

Lei等[41]研究發(fā)現(xiàn)糖基化制備的燕麥分離蛋白—β葡聚糖共價復(fù)合物在等電點附近的溶解度可由5.5%提高至38.6%。Cheng等[42]優(yōu)化了大米谷蛋白與葡聚糖濕熱反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)糖比5∶1、95 ℃條件下反應(yīng)20 min 可使接枝度達到52.02%，其溶解性和乳化活性都有明顯改善。Kasran等[43]研究發(fā)現(xiàn)大豆乳清蛋白與香豆膠混合物在60 ℃、75%相對濕度環(huán)境下反應(yīng)3 d所獲得的糖基化產(chǎn)物具有良好的溶解性。但Alvarez等[44]研究發(fā)現(xiàn)豬血血漿蛋白、血紅蛋白與10 kDa葡聚糖在80 ℃下加熱60 min所獲得的接枝產(chǎn)物，其熱穩(wěn)定性和乳化性均得到改善，溶解度反而有所降低，這可能歸因于蛋白質(zhì)以及與之反應(yīng)的多糖的復(fù)雜性[45]。

3.2 乳化性

蛋白質(zhì)可有效吸附在分散的油—水界面上，從而使其在乳化體系的形成中發(fā)揮乳化劑的作用。糖基化改善蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)主要取決于以下2種作用：接枝物的蛋白質(zhì)部分吸附在油—水界面上，導(dǎo)致表面張力顯著降低；接枝物的多糖分子鏈吸附在膜的周圍，形成立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增加了膜厚度和機械強度，而多糖的增稠和膠凝行為賦予了膠體穩(wěn)定性[46]，且分枝多糖提供的更大空間位阻可防止液滴聚集[47]。

Li等[48]研究了糖鏈長度對大豆蛋白水解產(chǎn)物(Mw>30 kDa)功能特性的影響，采用葡萄糖(180 Da)、麥芽糖(342 Da)、麥芽糊精(DE20)和葡聚糖(40 kDa)與大豆蛋白水解產(chǎn)物進行濕法改性，發(fā)現(xiàn)接枝產(chǎn)物的乳化性、乳化穩(wěn)定性均隨糖鏈長度的增長而提高。Safoura等[49]研究發(fā)現(xiàn)油菜分離蛋白與阿拉伯樹膠在90 ℃、pH 7.0 條件下獲得的接枝產(chǎn)物，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為61.72 m2/g、70.04 min，顯著高于兩者混合物和油菜分離蛋白。

3.3 起泡性

泡沫一般定義為氣泡在連續(xù)液相或者含可溶性表面活性劑狀態(tài)下逐漸形成的分散體系。蛋白質(zhì)起泡性是指蛋白質(zhì)在攪拌時并入大量空氣在氣—水界面形成薄膜的能力，因蛋白質(zhì)具有疏水和親水特性，使其能夠作為泡沫分散體系中的穩(wěn)定劑。

Cheng等[42]研究發(fā)現(xiàn)大米蛋白質(zhì)—葡聚糖接枝物的起泡性及起泡穩(wěn)定性較改性前分別提高了1.69,2.01倍。Jian等[50]采用干熱法制備的牛血清蛋白—葡萄糖接枝產(chǎn)物的起泡性從80%增加到160%，而發(fā)泡穩(wěn)定性從105%顯著降低到47.5%。

3.4 凝膠性

蛋白質(zhì)凝膠是通過共價鍵或非共價鍵連接的分子或顆粒所形成的連續(xù)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可容納大量溶劑和其他小分子，從而保留大量液體連續(xù)相，以此提高蛋白質(zhì)的持水性。糖基化改性可改變蛋白質(zhì)的凝膠特性，通過控制糖的濃度、分子量等因素，調(diào)節(jié)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而改變蛋白質(zhì)的凝膠質(zhì)構(gòu)[51]。

Spotti等[7]采用干熱法研究了牛奶乳清蛋白與葡聚糖(6，40,70 kDa)在60 ℃、63%相對濕度環(huán)境中加熱不同時間(2，5,9 d)的改性效果，結(jié)果表明反應(yīng)時間顯著影響乳清蛋白的凝膠特性；與乳清蛋白/葡聚糖混合物凝膠相比，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物凝膠在形變量達到80%時仍不會發(fā)生斷裂。Sun等[14]也報道了類似的研究結(jié)果。

3.5 抗氧化活性

不少學(xué)者將糖基化產(chǎn)物表現(xiàn)出的抗氧化活性，歸因于中間階段化合物[24,52](還原酮)以及晚期糖基化產(chǎn)物[53](類黑素)的形成。

Diego等[24]研究了乳清蛋白和葡萄糖、乳糖接枝產(chǎn)物的抗氧化活性，且比較了各階段反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性能，結(jié)果表明乳清蛋白—乳糖接枝產(chǎn)物具有更強的清除自由基能力。同時還發(fā)現(xiàn)抗氧化活性對熱處理時間有很強的相關(guān)性，在反應(yīng)速度較慢體系中，延長反應(yīng)時間有助于形成更多具有抗氧化活性的產(chǎn)物。Marija等[12]利用12%聚乙二醇(MW6000)制造大分子擁擠環(huán)境，研究了超聲輔助乳清蛋白—阿拉伯糖濕法改性效果，發(fā)現(xiàn)超聲處理能增加糖基化產(chǎn)物抑制脂質(zhì)過氧化能力，且在大分子擁擠環(huán)境下效果更明顯。Farzaneh等[35]研究發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白—麥芽糊精接枝產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性，且清除自由基的能力隨糖基化反應(yīng)程度的加劇而提高。

3.6 抗菌活性

糖基化改性形成的類黑素具有抗菌活性，可能與它們所帶陰離子電荷數(shù)以及螯合病原菌生長所必需的陽離子(如Cu2+、Fe2+、Zn2+)的能力相關(guān)[9,54]。

I.Habinshuti等[55]發(fā)現(xiàn)葵花蛋白與D-木糖在120 ℃水浴中加熱2 h所獲得的糖基化產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，最低抑菌濃度分別為86，70 mg/mL。Hashemi等[56]研究了pH 8.5、60 ℃、10 d 條件下溶菌酶與黃原膠的共價結(jié)合效果，與天然溶菌酶相比，當濃度為400 μg/mL時，接枝物表現(xiàn)出更廣泛的抗菌活性。Sheng等[17]研究表明溶菌酶和普魯蘭多糖在60 ℃、pH 7.5條件下反應(yīng)5 d即可形成具有良好抗菌活性的共價復(fù)合物。

現(xiàn)階段通過糖基化改善蛋白質(zhì)功能特性的研究大多停留在糖基化產(chǎn)物功能特性表征的層面上，蛋白質(zhì)糖基化分子修飾的反應(yīng)機制和糖基化產(chǎn)物構(gòu)效關(guān)系的研究還有待繼續(xù)深入。

4 展望

蛋白質(zhì)糖基化改性因反應(yīng)條件溫和、安全性高，且接枝物表現(xiàn)出多種功能特性而受到青睞，但現(xiàn)階段仍然存在蛋白質(zhì)—糖接枝物難以實現(xiàn)可控制備以及工業(yè)化、規(guī)?；瘧?yīng)用的局限性。未來研究方向可考慮從以下幾方面展開：① 通過美拉德反應(yīng)進程臨界條件的控制實現(xiàn)蛋白質(zhì)—糖接枝物定向可控制備；② 繼續(xù)深入探索蛋白質(zhì)糖基化分子修飾的反應(yīng)機制和糖基化產(chǎn)物的構(gòu)效關(guān)系；③ 微波、超聲波、脈沖電場等物理輔助手段促進蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)機理的研究；④ 糖基化產(chǎn)物的在醫(yī)學(xué)、材料等其它領(lǐng)域的應(yīng)用拓展。