腐乳前酵期微生物與理化成分的動態(tài)分析

許家威，李一紅，葉 芒，薛橋麗，王知榮，柴建國，胡永金*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學學報編輯部，云南 昆明 650201；3.云南羊泉生物科技股份有限公司，云南 牟定 675500）

大豆是原產(chǎn)于我國的世界主要糧食作物，其蛋白質(zhì)含量豐富，且富含各種必需氨基酸，是人們主要的植物蛋白來源[1]。幾千年來，中華民族創(chuàng)造了各式各樣的大豆制品，如豆豉、豆醬、豆腐、腐乳、腐竹等，豆品文化根深蒂固[2]，自2014年以來，每年有＞80%的國產(chǎn)大豆用于豆制品加工[3]，主要分為發(fā)酵和非發(fā)酵兩大塊，其中發(fā)酵豆制品由于其風味、口感、營養(yǎng)豐富等特點深受人們的喜愛[4]。

腐乳是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，已有近千年的歷史，含有豐富的營養(yǎng)成分，如必需氨基酸、脂肪酸、有機酸和維生素等，具有抗氧化活性、抗突變性和許多其他有益的生物活性[5-6]。腐乳是新鮮豆腐通過微生物和酶的發(fā)酵作用而形成的一種干酪型產(chǎn)品，在歐美，許多人把它稱作中國干酪（Chinese cheese）[7]。腐乳的生產(chǎn)過程一般分為前期培菌和后期酵期。腐乳的前酵期是整個生產(chǎn)的關鍵步驟，菌種在豆腐坯體上生長，形成茂密的菌絲后包裹坯體，使得蛋白質(zhì)部分降解[8]，同時在前酵期分泌的酶系將直接影響腐乳后酵期產(chǎn)香物質(zhì)的降解與酯化[9]，所以腐乳的前酵工藝將直接影響腐乳的品質(zhì)。而傳統(tǒng)的腐乳生產(chǎn)大部分還是作坊式生產(chǎn)，工業(yè)化水平低，大部分還是手工作業(yè)，在加工中極易受到環(huán)境微生物的污染，如喻世哲等[10-11]曾檢出腐乳生產(chǎn)車間環(huán)境中菌落總數(shù)為4.53 lgCFU/m3，而過多的微生物感染腐乳的生產(chǎn)不僅會導致風味口感的變化，更是會引起生物胺的累積[12]，從而影響腐乳的品質(zhì)。由于本樣品的生產(chǎn)采用的是自然發(fā)酵法，依靠稻草桿天然接種霉菌，生產(chǎn)環(huán)境較為粗獷，故本次實驗針對其中幾種對腐乳生產(chǎn)較為密切的微生物進行測定。

本研究對腐乳前酵各個時間段的菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)、乳酸菌數(shù)、毛霉和酵母數(shù)、水分、總酸、氨基酸態(tài)氮、水溶性蛋白以及游離氨基酸的含量進行檢測，了解前酵期腐乳的微生物和理化特性的動態(tài)變化，以期為腐乳工業(yè)化生產(chǎn)打下科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐白坯、自然發(fā)酵1 d、2 d、3 d毛坯、晾曬1 d、2 d毛坯、腌坯以及蘸料后腌坯：云南省牟定縣天臺陽泉油腐乳廠；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、平板計數(shù)培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；36%甲醛（不含聚合物）：成都市科隆化學品有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BSC-250恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安有限公司；PHS-3CpH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腐乳的加工工藝流程及操作要點

選料→浸泡→磨漿→過篩→煮漿→點漿→壓榨成坯→劃塊→發(fā)酵→晾曬→腌制→拌料→灌湯、裝瓶→后酵→成品

操作要點：

選料：選顆粒整齊、無雜質(zhì)、無蟲眼、無發(fā)霉變質(zhì)的新豆；

浸泡：常溫浸泡，浸泡到大豆無硬心；

磨漿：加水、下料要協(xié)調(diào)一致，不得中途斷水或斷料；

過濾：用紗布過濾豆渣；

煮漿：溫度控制在98～102℃，時間8～10 min；

點漿：酸漿水點漿，溫度控制在54～56℃；

壓榨成坯：機械壓榨成型，壓榨時間10～11 h；

劃塊：豆腐劃成4 cm×4 cm×2 cm；

發(fā)酵：發(fā)酵室內(nèi)溫度控制在20～24℃左右，發(fā)酵時間為65～72 h，發(fā)酵至表面布滿毛霉；

晾曬：太陽光自然照曬，晾曬時間8 h左右；

腌制：用食鹽腌制1 d，再用純糧白酒沖洗后瀝干；拌料：在腌坯上裹一層由辣椒粉、花椒粉、食鹽制成的輔料；

灌湯、裝瓶：將豆腐醅放入玻璃瓶中，加入菜籽油；

后酵：在常溫條件下放置，自然發(fā)酵3個月；

成品：包裝印刷后出廠。

1.3.2 微生物指標的測定

菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[13]進行測定；乳酸菌總數(shù)的測定參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[14]進行測定；霉菌和酵母的測定參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》進行測定[15]；芽孢桿菌的測定參照姚翔[16]的方法：在無菌條件下，將稱取的25 g樣品放入裝有225 mL無菌生理鹽水（含玻璃珠）的滅菌三角瓶中，浸泡，振搖30 min后，在電爐上加熱煮沸10～15 min后冷卻，用無菌水以1∶10的稀釋度遞增稀釋，選擇3個合適的稀釋度，取樣1 mL涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)。

1.3.3 理化指標分析檢測

水分含量的測定采用恒質(zhì)量法[17]；總酸及氨基酸態(tài)氮的測定參照SB/T 10170—2007《腐乳新標準》進行測定[17]；水溶性蛋白的測定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》進行測定[18]，轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.71；氨基酸含量的測定參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》進行測定[19]。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

運用IBM SPSS Statistics 19進行差異性顯著分析，運用Origin Pro 2018進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳前酵期微生物變化分析

腐乳的品質(zhì)與微生物有著密切的關聯(lián)，對腐乳前酵期微生物含量進行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 腐乳前酵期微生物的變化Fig.1 Changes of microorganisms during sufu pre-fermentation process

由圖1可知，在前酵期間，豆腐白坯和晾曬2 d后的豆腐坯以及腌坯期的微生物變化較大。其中白坯檢出的菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)、乳酸菌數(shù)以及毛霉和真菌數(shù)分別為5.10 lg（CFU/g）、5.01 lg（CFU/g）、4.94 lg（CFU/g）以及4.54 lg（CFU/g），隨著毛霉的生長，其他微生物也迅速繁衍，在晾曬期，菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)和毛霉和酵母的含量達到一個頂峰分別為9.11 lg（CFU/g）、8.87 lg（CFU/g）和7.77 lg（CFU/g），乳酸菌的含量在腌坯期達到最高值為8.28 lg（CFU/g）。而之后用食鹽鹽漬及白酒沖洗后的腌坯期豆腐坯的毛霉和酵母含量有一個明顯的下降，而芽孢桿菌和乳酸菌的數(shù)量無較大變化，表明食鹽及白酒對于真菌及一些其他微生物有較強的抑制作用。

2.2 腐乳前酵期水分含量的變化

在腐乳的前酵過程中不同的時期環(huán)境也不同，腐乳坯水分含量也會發(fā)生變化，采用恒質(zhì)量法對腐乳前酵期水分含量進行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 腐乳前酵期水分含量的變化Fig.2 Changes of moisture during sufu pre-fermentation process

微生物的生長需要合適的水分，尤其對于由微生物發(fā)酵的腐乳而言，前酵期水分含量的多少將直接影響發(fā)酵過程中毛霉的生長，水分過低會影響毛霉的有氧呼吸，將影響毛坯表面菌膜形成，水分過高則會為雜菌的生長提供有利條件[20]。此外，水分含量的多寡會影響水、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的作用力，從而對腐乳的形狀、質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響[21]。

由圖2可知，在前酵過程中，水分含量在毛霉發(fā)酵期間為77%左右，基本保持不變，適宜毛霉的生長，這也與圖1的微生物含量增長迅速相符合。在晾曬之后，水分含量的逐漸下降，有利于豆腐坯體的成型。

2.3 腐乳前酵期總酸含量的變化

隨著腐乳前發(fā)酵過程的進行，總酸的含量也在發(fā)生變化，不同時期總酸含量變化見圖3。

圖3 腐乳前酵期總酸含量的變化Fig.3 Changes of total acid during sufu pre-fermentation process

腐乳在發(fā)酵過程中由于微生物的作用，會分泌酶系，導致總酸的產(chǎn)生，而在前酵過程中，總酸主要來源就是乳酸菌代謝的作用，產(chǎn)生乳酸、醋酸、琥珀酸等有機酸[22]。由圖3可知，總酸含量在整個腐乳前酵期處于一個增長的過程，由白坯的0.089 g/100 g上升到蘸料后腌坯的0.385 g/100 g。尤其在毛霉發(fā)酵結(jié)束后，含量大幅度增長，考慮是因為水分含量的減少和代謝的積累導致總酸含量上升。

2.4 腐乳前酵期氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮的含量是衡量腐乳品質(zhì)的一項重要指標，腐乳前酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化結(jié)果見圖4。

圖4 腐乳前酵期氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen content during sufu pre-fermentation process

由圖4可知，在前酵過程中腐乳的游離氨基酸態(tài)氮含量一直處于增長的過程，主要原因是因為在前酵過程中，微生物不斷的生長繁殖，尤其是毛霉的不斷繁衍，產(chǎn)生了蛋白酶等一系列代謝產(chǎn)物，在酶系的作用下，蛋白質(zhì)不斷的降解，導致游離氨基酸態(tài)氮含量不斷上升，使得游離氨基酸態(tài)氮的含量由白坯的0.014 7 g/100 g上升到蘸料后腌坯的0.32 g/100 g。

2.5 腐乳前酵期水溶性蛋白含量的變化

采用凱氏定氮法測定腐乳前酵期不同階段的水溶性蛋白含量，結(jié)果見圖5。

圖5 腐乳前酵期水溶性蛋白含量的變化Fig.5 Changes of water-soluble protein content during sufu pre-fermentation process

如圖5所示，在前酵期腐乳的水溶性蛋白含量逐漸上升，這是由于毛霉等微生物在前酵過程中不斷分泌蛋白酶，蛋白酶加快了豆腐坯體中蛋白質(zhì)的降解，使得水溶性蛋白含量不斷上升，由白坯的3.07 g/100 g上升到蘸料后腌坯的10.23 g/100 g。而在前酵后期，由于食鹽、白酒的作用，降低了菌株和蛋白酶的活性[23]，導致蛋白質(zhì)降解速度減緩，后期水溶性蛋白含量增長緩慢。

2.6 腐乳前酵期游離氨基酸含量的變化

對腐乳前酵過程中不同時期的游離氨基酸含量進行測定結(jié)果見表1，總量變化見圖6。

表1 腐乳前酵期游離氨基酸含量的變化Table 1 Changes of free amino acids content during sufu pre-fermentation processmg/kg

圖6 腐乳前酵期游離氨基酸總量的變化Fig.6 Changes of total free amino acids content during sufu pre-fermentation process

風味是腐乳品質(zhì)的一項重要指標，氨基酸對于腐乳的風味有著巨大的貢獻，尤其是部分氨基酸本身就具有一定的鮮味[24]。在腐乳的前酵過程中，氨基酸的生成是由于微生物的生長繁殖，導致蛋白酶和肽酶的含量也不斷上升，在酶的作用下，使得豆腐醅中的大豆蛋白被分解成短肽和游離的氨基酸。由圖6可知，前階段的游離氨基酸的含量逐漸增長，從白坯的595.34 mg/kg增長到腌坯期的13 516.03 mg/kg，尤其是谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸以及賴氨酸含量增長迅速（表1），在后階段含量有所下降，分析是腌坯添加了辣椒、花椒等輔料后，游離氨基酸含量占總質(zhì)量的比重下降，同時微生物活性低導致游離氨基酸的積累不足，使得游離氨基酸含量有所下降。

3 結(jié)論

牟定腐乳前酵過程中，菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)以及霉菌和酵母的數(shù)量在晾曬期達到數(shù)量最高值分別為9.11 lg（CFU/g）、8.87 lg（CFU/g）和7.77 lg（CFU/g），乳酸菌數(shù)量在腌坯期達到最高值8.28 lg（CFU/g），而后均呈現(xiàn)下降趨勢。而水分含量在初期變化不大，在77%左右波動，而后逐漸減少?？偹帷被釕B(tài)氮及水溶性蛋白含量均呈上升的趨勢，分別由白坯的0.089 g/100 g、0.014 7 g/100 g、3.07 g/100 g升高到蘸料后腌坯的0.385 g/100 g、0.32 g/100 g和10.23 g/100 g，游離氨基酸含量在腌坯期達到最高為13 516.03 mg/kg。

菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)、乳酸菌數(shù)以及霉菌和酵母的數(shù)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，總體比白坯時有明顯的增加?？偹?、氨基酸態(tài)氮、水溶性蛋白以及游離氨基酸的含量也比白坯時有顯著增加。由此可推斷總酸、氨基酸態(tài)氮等理化性質(zhì)的變化與微生物的活動有著密切的關系，優(yōu)良的菌種對于腐乳前酵期的品質(zhì)形成具有重要的影響。通過對腐乳前酵期微生物與理化成分的分析，可以為工業(yè)化生產(chǎn)腐乳提供一定的理論依據(jù)。