利用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化雞母種培養(yǎng)基*

袁征超，薛玲娜，蘇楚亮，楊昱儀，盧 意，莫美華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

1 材料與方法

1.1 供試菌種

1.2 PDA培養(yǎng)基制備

選取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過(guò)濾，再加15 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后于121℃滅菌20 min，取出冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌種活化

1.4 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)法

1.4.1 可溶性碳酸鈣清液制備

稱取10 g可溶性輕質(zhì)碳酸鈣，溶于1 L水中，攪拌溶解靜置10 min后，取上層清液，添加相應(yīng)量到相應(yīng)的試驗(yàn)組中。

1.4.2 蟻穴浸提物的制備

1.4.3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

（1）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案的制定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)雞樅菌絲生長(zhǎng)較好的碳源、氮源、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、蟻穴物、抑菌劑，如馬鈴薯汁、麥芽糖、酵母膏、VB9、脯氨酸、碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蟻穴浸提物、鏈霉素10個(gè)因素作為均勻設(shè)計(jì)的參試因子，每因子設(shè)12個(gè)水平，見表1[8-9]，采用10因素12水平的均勻設(shè)計(jì)表U1（2121）0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表2，得出雞菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化方案，見表3。按照表3的試驗(yàn)方案配制母種培養(yǎng)基，在121℃滅菌30 min，倒于平板，冷卻凝固后，接入準(zhǔn)備好的菌種圓片，倒置于26℃恒溫生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。

（2）各組分的添加方式

馬鈴薯汁、麥芽糖、酵母膏、可溶性碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蟻穴浸提物配成母種培養(yǎng)基的主液，121℃高壓蒸汽滅菌30 min；VB9、脯氨酸、鏈霉素3種熱敏性的組分通過(guò)濾徑為0.22μm無(wú)菌脂溶性濾膜過(guò)濾后，添加到培養(yǎng)基主液中。

表1 參試因子水平表Tab.1 List with regard to all relative parameters

試驗(yàn)號(hào) 列號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 3 4 5 6 8 9 10 12 2 2 4 6 8 10 12 3 5 7 11 3 9 12 2 5 11 1 4 10 4 4 8 12 3 7 11 6 10 1 9 3 6 5 5 10 2 7 12 4 1 6 11 8 6 6 12 5 11 4 10 9 2 8 7 7 7 1 8 2 9 3 4 11 5 6 8 3 11 6 1 9 12 7 2 5 9 9 5 1 10 6 2 7 3 12 4 8 10 10 7 4 1 11 8 2 12 9 3 11 11 9 7 5 3 1 10 8 6 2 12 12 11 10 9 8 7 5 4 3 1

試驗(yàn)組X2X3X4X5X6X7X8X9X10/（mg·L-1）1 0 2.0 1.0 60.0 80.0 5.0 7.0 8.0 180.0 22.0 2 20.0 6.0 2.5 140.0 180.0 11.0 2.0 4.0 120.0 20.0 3 40.0 10.0 4.0 220.0 20.0 4.0 10.0 0.0 60.0 18.0 4 60.0 14.0 5.5 40.0 120.0 10.0 5.0 9.0 0 16.0 5 80.0 18.0 0.5 120.0 220.0 3.0 0.0 5.0 200.0 14.0 6 100.0 22.0 2.0 200.0 60.0 9.0 8.0 1.0 140.0 12.0 7 120.0 0 3.5 20.0 100.0 2.0 3.0 10.0 80.0 10.0 8 140.0 4.0 5.0 100.0 0 8.0 11.0 6.0 20.0 8.0 9 160.0 8.0 0 180.0 100.0 1.0 6.0 2.0 220.0 6.0 10 180.0 12.0 1.5 0 200.0 7.0 1.0 11.0 160.0 4.0 11 200.0 16.0 3.0 80.0 40.0 0 9.0 7.0 100.0 2.0 12 220.0 20.0 4.5 160.0 140.0 6.0 4.0 3.0 40.0 0各參試因子用量X1/（mL·L-1）/（g·L-1）/（g·L-1）/（μg·L-1）/（μg·L-1）/（mL·L-1）/（g·L-1）/（g·L-1）/（mL·L-1）

（3） 接種培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)的無(wú)菌環(huán)境下，將制備好的直徑為0.35 cm的雞菌菌種圓片，接入到相應(yīng)的培養(yǎng)基平板中。將接種好的平板倒置，于26℃恒溫生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用DPSv9.5數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)處理。采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。對(duì)均勻設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果使用二次多項(xiàng)式回歸分析方法，然后通過(guò)數(shù)學(xué)模型模擬獲得最優(yōu)配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表4。

試驗(yàn)結(jié)果的指標(biāo)為菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲潔白度和菌絲密度[10]。以菌絲生長(zhǎng)速度為目標(biāo)函數(shù)（Y），用DPSv9.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，所得回歸方程為：

表4 雞菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the experiments above by using orthogonal devices

表4 雞菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the experiments above by using orthogonal devices

注：“*”越多說(shuō)明菌絲越潔白；“＋”越多說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)密度越濃厚。Notes：The more*means more dense mass of mycelia，the more＋means more witness mass of mycelia.

試驗(yàn)組 生長(zhǎng)速度/（mm·d-1） 潔白度 菌絲密度11 1.4095±0.0244a *** ＋＋＋10 1.2548±0.0206b **** ＋＋＋＋5 1.2452±0.0012bc *** ＋＋＋6 1.2131±0.0239bcd ** ＋＋12 1.2071±0.0126bcd ** ＋＋9 1.1952±0.0131cd **** ＋＋＋＋2 1.1857±0.0186d * ＋4 1.1690±0.0160d ** ＋＋＋3 1.1048±0.0131e ** ＋＋7 1.0524±0.0113f ** ＋8 0.9583±0.0131g * ＋＋1 0.9048±0.0121h * ＋

對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999977，由此可見，菌絲生長(zhǎng)速度與回歸方程中試驗(yàn)因素的含量有密切的相關(guān)性，其顯著性檢驗(yàn)值F值=4 752.0164，顯著水平P值=0.0002＜0.01，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.0022，調(diào)整相關(guān)系數(shù)Ra=0.999871，回歸方程極顯著，說(shuō)明方程的可信度高。

方程中各項(xiàng)試驗(yàn)因子的回歸系數(shù)和t檢驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 各回歸項(xiàng)的回歸系數(shù)檢驗(yàn)Tab.5 Regression coefficient test of each regression item

由表5可知，方程中有X1（馬鈴薯汁） 與X2（麥芽糖）、X1（馬鈴薯汁） 與X7（磷酸二氫鉀）、X2（麥芽糖） 與X6（碳酸鈣清液）、X4（VB）9與X8（硫酸鎂）、X6（碳酸鈣清液） 與X7（磷酸二氫鉀） 共5組的交互作用顯著水平小于0.01，說(shuō)明馬鈴薯汁和麥芽糖、馬鈴薯汁和磷酸二氫鉀、麥芽糖和碳酸鈣清液、VB9和硫酸鎂、碳酸鈣清液和磷酸二氫鉀等的交互作用對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響很大，達(dá)到極顯著水平。麥芽糖、碳酸鈣清液對(duì)雞菌菌絲的生長(zhǎng)達(dá)到顯著水平。雞菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 雞菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of the optimum uniform design of stock culture medium of Termitomyces spp.

結(jié)合圖1和表4可以看出，得出試驗(yàn)組11的菌絲生長(zhǎng)速度最快，該條件對(duì)菌絲的促生長(zhǎng)作用效果明顯，同時(shí)菌絲潔白度和菌絲密度兩個(gè)指標(biāo)的相對(duì)值也較好，該組直觀表現(xiàn)最優(yōu)；而試驗(yàn)組10和試驗(yàn)組9中，菌絲潔白度和菌絲密度兩指標(biāo)明顯，但試驗(yàn)組9的菌絲生長(zhǎng)速度較試驗(yàn)組10要慢，因此若針對(duì)菌絲潔白度和菌絲密度的高效培養(yǎng)，可以選擇試驗(yàn)組10。樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差見表6。

根據(jù)表6數(shù)據(jù)顯示，觀察值與擬合值接近，最大擬合誤差絕對(duì)值僅為0.0018，進(jìn)一步說(shuō)明了回歸方程的準(zhǔn)確性。

2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

通過(guò)DPSv9.50進(jìn)行回歸分析，并通過(guò)數(shù)學(xué)模型模擬得到雞母種培養(yǎng)基的理論最優(yōu)組合如表7所示，將其與組間最優(yōu)配方11、配方10和真菌通用培養(yǎng)基PDA進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表8所示。

結(jié)合表8和圖2可知，在理論最優(yōu)配方和配方11的培養(yǎng)基中，雞菌絲生長(zhǎng)速度最快，且兩者差異不顯著，配方10與配方11相比菌絲的生長(zhǎng)速度差異也不顯著，在PDA上的生長(zhǎng)速度最慢，且與其他配方存在顯著差異（P＜0.05）。因此，雞菌菌絲生長(zhǎng)最快的母種培養(yǎng)基理論最優(yōu)組，具體配方為馬鈴薯汁 126.20 mL·L-1、麥芽糖 11.63 g·L-1、酵母膏5.50 g·L-1、VB947.90 μg·L-1、脯氨酸 23.37 μg·L-1、可溶性碳酸鈣清液0、磷酸二氫鉀0.07 g·L-1、硫酸鎂 4.19 g·L-1、蟻穴浸提物 61.82 mL·L-1、鏈霉素2.33 mg·L-1。

表6 試驗(yàn)組的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.6 Observed value，fitted value and fitted error of the samples

2.3培養(yǎng)基中硫酸鎂（X） 8與生長(zhǎng)速度關(guān)系

培養(yǎng)基中硫酸鎂（X）8與生長(zhǎng)速度關(guān)系見圖3。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)的培養(yǎng)基Tab.7 The medium of the control experiments

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果Tab.8 Results of the control experiments

圖2 雞菌培養(yǎng)基的對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of the control experiments of medium of Termitomyces spp.

3 結(jié)論

圖3硫酸鎂（X8）與生長(zhǎng)速度關(guān)系Fig.3 Effect of magnesium sulfate （X8） on the mycelial growth rate

從均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果可以看出理論最優(yōu)配方和配方11的生長(zhǎng)速度最快，兩者間無(wú)顯著差異（P＜0.05），兩者的菌絲潔白度、菌絲密度間也無(wú)顯著差異；雖然配方10的生長(zhǎng)速度比理論最優(yōu)配方慢，且兩者間差異顯著，但是配方10的菌絲潔白度、菌絲密度均優(yōu)于理論最優(yōu)配方和配方11。因此確定雞菌母種培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度最優(yōu)配方為：馬鈴薯汁 126.20 mL·L-1、麥芽糖 11.63 g·L-1、酵母膏 5.50 g·L-1、VB947.90 μg·L-1、脯氨酸 23.37 μg·L-1、可溶性碳酸鈣清液0、磷酸二氫鉀0.07 g·L-1、硫酸鎂4.19 g·L-1、蟻穴浸提物 61.82 mL·L-1、鏈霉素 2.33 mg·L-1。菌絲生長(zhǎng)最濃密的配方為：馬鈴薯汁180.00 mL·L-1、麥芽糖 12.00 g·L-1、酵母膏 1.50 g·L-1、VB90、脯氨酸200.00μg·L-1、可溶性碳酸鈣清液7.00 mL·L-1、磷酸二氫鉀 1.00 g·L-1、硫酸鎂 11.00 g·L-1、蟻穴浸提物 160.00 mL·L-1、鏈霉素 4.00 mg·L-1。