基于我國人群胃腸消化特征的土壤中As的人體可給性研究

鄭 瑞,彭 超,鐘茂生,3*,姜 林*,韓 丹,張 丹

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基于我國人群胃腸消化特征的土壤中As的人體可給性研究

鄭 瑞1,2,彭 超2,鐘茂生2,3*,姜 林2*,韓 丹2,張 丹2

(1.首都師范大學資源環(huán)境與旅游學院,北京 100048；2.北京市環(huán)境保護科學研究院,國家城市環(huán)境污染控制工程技術研究中心,污染場地風險模擬與修復北京市重點實驗室,北京 100037；3.北京師范大學環(huán)境學院,北京 100875)

基于我國人群胃腸消化特征,采用醫(yī)學配方模擬胃腸消化方法測試了來自大連、湖南和廣西的13個受重金屬污染土壤中As的人體可給性,分析了土壤理化參數(shù)與可給性的相關關系及提取液中酶、胃腸液pH值、提取時間對As的人體可給性的影響.結果表明,醫(yī)學配方可給性測試中,供試土樣在胃、腸階段As的人體可給性分別為5.03%~44.54%和10.77%~51.46%,平均值為18.08%、29.32%.胃階段As的可給性濃度與土壤中總As含量(TAs)、總P含量(TP)極顯著正相關,與總Al含量(TAl)、土壤pH值、總有機質含量(TOM)顯著相關;腸階段As的可給性濃度與土壤中(TAs)、胃階段As的可給性濃度、(TP)極顯著相關,與土壤pH值、(TAl)和(TOM)顯著相關.胃階段提取液中的胃蛋白酶顯著降低了As的可給性,而腸階段添加胰蛋白酶As的可給性沒有明顯變化.胃、腸階段分別在pH值為0.9和5.0時可給性最大,0.9和5.0可分別作為土壤As在可給性測試過程中模擬胃腸液的pH值.胃、腸階段在提取時間分別為1.0h、4.0h時可給性達到最大,且之后基本不變,1.0h、4.0h可作為模擬測試As在胃腸中可給性的提取時間.研究結果表明開展基于我國人群胃腸消化特征的土壤重金屬人體可給性測試方法具有重要意義.

As；可給性；醫(yī)學配方；胃腸消化；影響因素

近年來,世界范圍內土壤遭受了不同程度的As污染.土壤As污染具有長期性、隱蔽性和不可逆轉性[1],一旦遭受As污染,治理難度大且周期長.由于人類對食物鏈途徑的有效控制,口部無意攝入的土壤As對人體攝入As總量的貢獻率越來越大[2].當前人體健康風險評估以土壤中重金屬總量為基準計算暴露劑量.但諸多研究表明,重金屬并不能完全解吸進入人體胃腸液[3],因此使用重金屬總量進行評估結果過于保守,造成場地過度修復.越來越多研究人員推薦采用模擬人體胃腸消化吸收的方法測定土壤重金屬溶解于胃腸系統(tǒng)的含量,即人體可給性重金屬(指土壤重金屬經(jīng)口攝入后,溶解于胃腸液中的含量(即人體可給量)與攝入重金屬總量的比值[4]).準確測定土壤中As的人體可給性是評估As人體健康風險的關鍵問題[5].

目前國際上普遍采用體外方法模擬人體胃腸消化測試重金屬的人體可給性,主要測試方法有PBET(Physiologically Based Extraction Test)、SBET (Simplified Bioaccessibility Extraction Test)、UBM (Unified Bioaccessibility Method)、DIN(deutsches institute für normung)、IVG(in vitro gastrointestinal)等.國際現(xiàn)有方法主要依據(jù)國外人群胃腸生理特征確定模擬胃腸液組分、pH值和提取時間.但由于東西方飲食習慣和生理特征的差異,我國人群胃腸道pH值及食物在胃腸道停留時間與國外人群存在差異.當前各種可給性測試方法的模擬胃腸液組分復雜,但各組分對重金屬人體可給性測試結果的影響未見系統(tǒng)報道[6].因此,研究更符合我國人群胃腸消化特征的可給性測試方法很有必要.

目前國內沒有關于土壤重金屬人體可給性測試中胃腸液組分的相關研究,但醫(yī)學界普遍采用中華藥典[7]推薦的模擬人體胃腸液成分作為研究藥物體外釋放的模擬胃腸液[8-9],可認為該成分也適用于重金屬在人體胃腸液中的釋放研究.該研究采用上述中華藥典中胃腸液配方測試土壤As經(jīng)口攝入后在胃腸液中的釋放特征,分析了土壤中As人體可給性的影響因素,與國外相關方法測試結果進行了比較,并對可給性測試過程中模擬胃腸液中酶、胃腸液pH值和提取時間對測試結果的影響進行了研究.

1 材料與方法

1.1 供試土樣

供試土樣取自大連某化工廠(土樣編號:S1、S2、S3、S4、S5)、湖南某冶煉廠周邊下風向(S6、S7、S8、S9、S10、S11)及廣西壯族自治區(qū)某尾礦庫下游(S12、S13)受重金屬污染場地.經(jīng)風干、研磨后,每份土樣取部分過2mm尼龍篩測試其基本理化性質;由查閱得知0.25mm的土壤顆粒在手-口接觸過程中最容易被人體攝入[3,10],故剩余部分過0.25mm尼龍篩用于可給性測試.

1.2 理化性質測試

供試土樣用硝酸+氫氟酸消解后用ICP-MS(安捷倫7500a,美國)測定土壤中(TAs)、(TFe)、(TAl)、(TMn);(TP)采用酸溶-鉬銻抗比色法[11]測定;(TOM)采用內加熱重鉻酸鉀氧化-紫外分光光度法測定[11];黏粒含量采用Mastersizer 2000 粒徑分析儀(MALVERN,UK)測定[12];碳酸鹽含量[以(CaCO3)計]采用鹽酸-氫氧化鈉容量滴定法[11]測定;土壤pH值采用電位法測定[11].土樣基本理化性質參數(shù)見表1.

表1 供試土樣基本理化性質參數(shù)

1.3 醫(yī)學配方可給性測試

根據(jù)國內醫(yī)學資料中華藥典2010[7],采用一種醫(yī)學配方對13份土樣進行人體胃腸模擬浸出實驗,具體測試過程采用國外最新研究的UBM方法[13]測試步驟.由于唾液pH值為6.5,重金屬在口腔中的釋放停留時間僅15s,釋放量可忽略不計,故該研究僅模擬土壤As在胃腸階段的釋放過程.測試過程中每個土樣設置一個平行樣,除胃、腸液配方與UBM不同,其它實驗工況均相同,UBM方法中的膽汁液用蒸餾水代替.醫(yī)學配方如下:(1)胃液:取鹽酸16.4mL,加水800mL、胃蛋白酶10g,充分搖勻使酶完全溶解后,加水稀釋至1000mL.(2)腸液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水500mL使其溶解,用稀NaOH溶液調節(jié)pH值至6.8;另取胰蛋白酶10g,加水攪拌使其溶解,將兩液混合后,加水稀釋至1000mL.

所用模擬胃腸液在實驗前1d制備,保證其新鮮和完全溶解.測試前加熱模擬胃腸液2h以上(37℃).測試過程如下:

(1)胃階段:稱取20g土樣置于2L HDPE(高密度聚氯乙烯)瓶中,加入450mL模擬胃液,混合均勻,用10mol/L NaOH溶液或37%HCl調節(jié)pH值至(1.1±0.2).將HDPE瓶放入預熱至(37±2)℃的TCLP翻轉儀中翻轉0.5h后取出,再次測定并調節(jié)pH值至(1.1±0.2),隨后繼續(xù)翻轉0.5h.翻轉結束后測定pH值是否介于(1.1±0.2),否則重新試驗.將反應液轉移至離心管中,以4500r/min離心10min,過0.45μm醋酸纖維膜過濾,取50mL過濾后的模擬胃液加1~2滴1% HNO3,4℃保存待測.用ICP-MS測定模擬胃液中As的濃度(GAs).

(2)腸階段:向胃階段結束后的HDPE瓶中補充新鮮胃液至450mL,再加入1200mL模擬腸液(900mL腸液+300mL蒸餾水),混合均勻后用10mol/L NaOH溶液或37%HCl調節(jié)pH值至(6.3±0.5),然后翻轉2h.取出HDPE瓶調節(jié)pH值至(6.3±0.5),之后繼續(xù)翻轉2h.翻轉結束后測定pH值是否為(6.3±0.5),否則重新試驗.將反應液轉移至離心管中,4500r/min離心10min,過0.45μm醋酸纖維膜過濾,取50mL過濾后的模擬腸液加1~2滴1% HNO3, 4℃保存待測.用ICP-MS測定模擬腸液中As的濃度(GIAs).

1.4 可給性濃度及可給性

土壤中As在胃腸階段的可給性濃度及可給性計算公式如下:

式中:c為胃階段As的可給性濃度,mg/kg;c為腸階段As的可給性濃度,mg/kg;(GAs)為模擬胃液中As的濃度,μg/L;(GIAs)為模擬腸液中As的濃度,μg/L;v為模擬胃液體積,L;v為模擬腸液體積,L;為測試過程中土壤質量,g;c為土壤中As的總濃度, mg/kg;BioG為胃階段As的可給性,無量綱;BioGI為腸階段As的可給性,無量綱.

1.5 質量控制

醫(yī)學配方可給性測試及供試土樣理化性質測試中每個樣品均設置兩個平行樣,平行樣相對偏差為1.9%~8.5%,樣品加標回收率為96%~107%.

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS22.0進行整理和統(tǒng)計分析,采用Origin 9.1進行圖形繪制.

2 結果與討論

2.1 人體可給性測試結果

根據(jù)醫(yī)學配方可給性測試結果(圖1)顯示,胃、腸階段As的可給性分別為5.03%~44.54%和10.77%~51.46%,平均值分別為18.08%、29.32%.除S5外,供試土樣中As在腸階段的可給性均高于胃階段,前者是后者的1.2~5.4倍.Girouard等[14]采用IVG方法對加拿大蒙特利爾地區(qū)20個As污染土樣進行可給性測試,結果顯示As在腸階段的可給性大于胃階段,胃、腸階段可給性分別為16.2%~63.6%和17.0%~66.3%,平均值32.5%、36.6%.Whitacre等[15]和Pouschat等[16]對As的可給性測試也顯示腸階段可給性大于胃階段.鐘茂生等[17]曾采用UBM方法測試了本試驗所用供試土樣中As的可給性,與本研究所得結果差異很大.供試土樣采用UBM方法測試時胃階段可給性高于腸階段,胃、腸階段可給性分別為3.9%~49.8%、1.2%~13.6%,平均值19.6%、6.0%.經(jīng)比較,胃階段采用UBM方法As的可給性是采用醫(yī)學配方的0.66~1.80倍,平均1.14倍;腸階段則是0.06~1.00倍,平均0.29倍.對比可知腸階段采用醫(yī)學配方As可給性顯著高于UBM方法.

圖1 胃、腸階段As的人體可給性

由于胃階段醫(yī)學配方和UBM方法對土壤中As的浸出效果相當,模擬胃液組分可簡化為鹽酸和胃蛋白酶.Stefaniak[18]等以ASTM、USP和NIOSH 3種模擬胃液測試土壤重金屬胃階段可給性,結果顯示對于鈷等溶解性較高的重金屬,組分相對簡單的胃液更適用于其可給性測試,因為相對簡單組分對胃階段可給性較高的重金屬影響較小.腸階段除S5中2種方法As的可給性基本一致外,其余土樣采用醫(yī)學配方As的可給性均顯著高于UBM方法.膽汁鹽是一種生物表面活性劑[19],Oomen等[20]研究指出,膽汁鹽能與重金屬形成復合物降低重金屬的可給性.Alava等[21]研究也表明膽汁鹽會導致As和Fe之間的相互作用從而使As的可給性降低.本研究所用醫(yī)學配方用蒸餾水代替膽汁液,消除了其與重金屬結合對As可給性的抑制作用,故腸階段采用醫(yī)學配方時As的可給性大于UBM方法.

2.2 土壤理化參數(shù)影響分析

雙變量相關性分析結果顯示,醫(yī)學配方可給性測試過程中胃階段As的可給性濃度與土壤中(TAs)(<0.001,=13)、(TP)(<0.001,=13)極顯著正相關,與(TAl)(=0.036,=13)顯著正相關,與土壤pH值(=0.006,=13)和(TOM)(=0.018,=13)顯著負相關,這與已有研究結論類似.李繼寧等[22]采用SBET方法對株洲市42個農田土壤樣品進行可給性測試,結果顯示胃階段As的可給性濃度與土壤中(TAs)極顯著正相關.Xia等[23]采用UBM方法測試澳大利亞的7種土樣中As的可給性,結果顯示胃及腸階段As的可給性濃度與土壤中(TAs)、土壤pH值及(TOM)顯著相關.Bradham等[24]采用SBRC(solubility/bioavailability research consortium)方法對某冶煉廠污染土壤進行可給性測試發(fā)現(xiàn),土壤中As的可給性濃度與(TAl)顯著負相關.

腸階段As的可給性濃度與(TAs)(<0.001,=13)、胃階段As的可給性濃度(<0.001,=13)、(TP)(<0.001,=13)極顯著正相關,與土壤pH值(=0.004,=13)、(TAl)(=0.012,=13)、(TOM)(= 0.014,=13)顯著相關.重金屬進入腸消化階段前,需要在胃中消化溶解一段時間,因此胃階段As的可給性濃度將決定腸階段As可給性濃度,故后者與前者顯著正相關.由于As在胃階段的可給性濃度與(TAs)和(TP)極顯著正相關,與(TAl)顯著正相關,由相關性傳遞理論[25],腸階段As的可給性濃度也與(TAs)和(TP)極顯著正相關,與(TAl)顯著正相關.也有已經(jīng)報道過的與土壤中As的可給性相關的土壤理化參數(shù)在該研究中未得到驗證.如土壤中Mn和As能結合形成較穩(wěn)定礦物Mn3(AsO4)2來降低As的活性,從而使其可給性降低[26].Fe氧化物也被認為是As的主要結合點位之一,能與As結合形成較穩(wěn)定的化合物,因此與As的可給性呈負相關,但在本研究中As和Fe氧化物并未表現(xiàn)出很好的相關性,此現(xiàn)象也有報道[14,16,22,26-27].此外,研究報道[28]土壤中黏粒含量與As的可給性也有很好的相關性.比較發(fā)現(xiàn),采用醫(yī)學配方可給性測試中胃及腸階段的可給性濃度影響因素具有很大的一致性,除腸階段可給性濃度與胃階段可給性濃度極顯著相關外,其他影響因素均相同.

2.3 提取液酶的影響

已有研究[29]表明,模擬胃腸液中添加胃蛋白酶和胰蛋白酶會影響重金屬可給性.該研究采用上述醫(yī)學配方可給性測試過程對胃腸階段提取過程中胃蛋白酶和胰蛋白酶對可給性的影響進行測試.

根據(jù)提取液中有無胃蛋白酶時胃階段As的可給性(圖2a)可知,胃蛋白酶對胃階段As的可給性有顯著影響(=0.003,n=11).除S10外,供試土樣均在無胃蛋白酶時As的可給性更高,其值為添加胃蛋白酶時的1.09~4.97倍,平均為2倍.原因是胃蛋白酶與As發(fā)生絡合反應對其浸出效果產生抑制作用[29].

胃階段結束后,對腸階段是否添加胰蛋白酶對As可給性的影響進行測試.根據(jù)有無胰蛋白酶時腸階段As的可給性(圖2b)可知,除S8中添加胰蛋白酶的可給性是無胰蛋白酶的24.96倍之外,其余土樣是否添加胰蛋白酶腸階段As的可給性相差不大(=0.719,=13).無胰蛋白酶時As的可給性是添加胰蛋白酶的0.04~2.22倍,平均為1.16倍.S8可能是由于(TAs)較高,土壤碳酸鹽含量低,且As較易與胰蛋白酶結合導致的.

2.4 模擬胃腸液pH值影響

研究表明,模擬胃腸液的pH值控制是可給性測試的關鍵影響因素之一[3,30].對于污染物特別是重金屬離子的可給性,pH值對其溶解析出有很大影響[30].

采用上述醫(yī)學配方可給性測試過程分別測定6份供試土樣(S1、S2、S6、S9、S10、S13)在pH=0.7、1.1、2.0、4.0及pH=5.0、6.3、7.0、8.0時胃、腸階段As的可給性.根據(jù)胃階段As可給性隨模擬胃液pH值變化曲線(圖3a)可知,pH值在0.7~4.0范圍內,胃階段As的可給性隨模擬胃液pH值升高而降低.隨著pH值增大,重金屬易與其他離子或基團形成沉淀或被土壤顆粒再吸附,從而使可給性降低.鐘松雄等[31]采用PBET、IVG、SBRC(模擬胃液pH值分別為2.5、1.8、1.5) 3種方法測試同一批土樣胃階段As的可給性,結果顯示IVG、SBRC方法所得可給性高于PBET方法,原因是IVG和SBRC方法的模擬胃液具有相對較低的pH值. Li等[32]采用SBRC、IVG、DIN、PBET(模擬胃液pH值分別為1.5、1.8、2.0、2.5)方法測試24份室內灰塵中As的可給性,所得結果為SBRC方法中As的可給性最大,也歸因于SBRC在胃階段具有較低的pH值,這與本研究結果一致.pH=0.7時,除S10外,土樣中As在胃階段可給性都達到最大,S10可能與其土壤pH值偏低、碳酸鹽含量較低以及土壤黏粒含量偏高3個因素的共同影響有關.生理學資料[33-34]顯示,正常人體胃液pH值為0.9~2.0,故選用該試驗中可給性達到最大的0.9作為基于我國人群胃腸消化特征的醫(yī)學配方可給性測試的模擬胃液pH值.

根據(jù)供試土樣在腸階段As的可給性隨pH值變化曲線(圖3b)顯示,pH=5.0時6種土樣在腸階段As的可給性達到最大,之后隨腸液pH值的升高而大幅度降低.原因也是隨著腸液pH值增大,土樣中As與其它離子或基團形成沉淀或重吸附到土壤顆粒上使得可給性降低.同時,醫(yī)學資料顯示,整個腸消化道在進食后的pH值最低為5.0~5.5,故可選用腸階段As的可給性達到最大的5.0作為腸階段最佳pH值.國外研究結果與本研究有所差異,如Ruby等[35]測試某礦山廢棄物中Pb的可給性時,對兔子采用體內試驗方法測試其胃腸道pH值,確定采用1.3和7.0分別作為可給性體外測試模擬胃腸液pH值.

該研究結果證明,國外現(xiàn)有可給性測試方法中胃腸液pH值的設定并不符合我國人群胃腸消化特征,需要進一步系統(tǒng)研究更符合我國人群可給性測試的胃腸液pH值.

2.5 提取時間影響

國外現(xiàn)有可給性測試方法在提取時間上存在差異,因此該研究對胃腸階段提取時間對As的可給性的影響進行測試,測試方法同上.

在pH=1.1時進行胃階段測試.分別測定6份供試土樣(S1、S2、S6、S9、S10 、S13)在=0.5, 1.0, 3.0, 6.0, 8.0, 12.0h時胃階段As的可給性,對應時間取樣分析.根據(jù)供試土樣中As在胃階段可給性隨提取時間變化(圖4a),當t=1.0h時,As的可給性基本達到最大值,之后隨提取時間增加,可給性基本保持不變.故采用1h作為胃階段提取時間.

在pH=5.0時進行腸階段測試.分別在=1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0h時取樣分析.根據(jù)腸階段As的可給性隨提取時間變化曲線(圖4b)可知, As的可給性在4h時普遍達到最大值,S9、S10在4h之后可給性小幅度上升,但也基本保持平穩(wěn).故選用4.0h作為腸階段提取時間(正常人體食物通過小腸時間:1~6h).國外測試結果與本研究有所差異,如Ruby等[35]測試某礦山廢棄物中Pb的可給性時,研究得出Pb的可給性在2h時達到最大,之后基本不變.

由As可給性隨時間變化結果,對土壤中As的浸出量隨浸出時間的變化采用2階段浸出模型進行擬合,擬合方法見公式(5).

式中:S為土壤中As在時間后的累積浸出量, mg/kg;0為土壤中As總量,mg/kg;S/0為胃或腸階段As的可給性,無量綱;為浸出時間,min;rap和slow分別為土壤中As快解吸部分和慢解吸部分與土壤中As總量的比值,無量綱;rap和slow分別為土壤中As快解吸部分和慢解吸部分的解吸速率, min-1.

模型假設slow<

擬合結果顯示,模型擬合的決定系數(shù)2可達0.9543~0.9990,說明供試土樣中As的解吸符合兩階段模型.rap

表2 土壤中As浸出的動力學模型擬合結果

注:slow<

3 結論

3.1 采用醫(yī)學配方對土壤As的可給性測試中供試土樣在胃階段As的可給性為5.03%~44.54%,平均值18.08%;腸階段As的可給性為10.77%~51.46%,平均值29.32%.As在腸階段的可給性是胃階段的1.2~5.4倍.

3.2 影響胃階段As可給性濃度的最顯著因素為土壤中(TAs)、(TP),其次為土壤pH值、(TOM)和(TAl);腸階段As可給性濃度的最顯著影響因素為(TAs)、胃階段As的可給性濃度、(TP),其次為土壤pH值、(TAl)和(TOM).

3.3 胃蛋白酶顯著降低了胃階段As的可給性,胰蛋白酶對As在腸階段的可給性則影響較小.

3.4 基于我國人群胃腸消化特征,推薦采用0.9和5.0分別作為醫(yī)學配方可給性測試中胃、腸階段提取液pH值;1.0h、4.0h分別作為胃、腸階段提取時間.

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Study on arsenic bioaccessibility in soil based on Chinese gastrointestinal digestion characteristics.

ZHENG Rui1,2, PENG Chao2, ZHONG Mao-sheng2,3*, JIANG Lin2*, HAN Dan2, ZHANG Dan2

(1.School of Environment and Tourism of Capital Normal University, Beijing 100048, China；2.Beijing Municipal Research Institute of Environmental Protection, National Engineering Research Centre of Urban Environmental Pollution Control, Beijing Key Laboratory for Risk Modeling and Remediation of Contaminated Sites, Beijing 100037, China；3.School of Environment of Beijing Normal University, Beijing 100875, China)., 2019,39(1)：235~242

In order to considering the digestive characteristics of Chinese people, gastric and intestinal juice formulated in the Chinese Pharmacopoeia were used as digestive solutions in measuring as bioaccessibility of 13 soil samples collected from Dalian, Hunan and Guangxi in this study. The correlation between soil physicochemical parameters and As bioaccessibility was investigated, and the effects of enzymes and the pH of gastrointestinal fluid as well as the digestive duration on As bioaccessibility were explored. The results showed that the bioaccessibility of As in stomach and intestine were 5.03%~44.54% and 10.77%~51.46% respectively, with the arithmetic means at 18.08% and 29.32%. Two most significant factors influencing the As bioaccessibility in stomach were(TAs) and(TP), followed by(TAl), pH of soil samples and(TOM). The most significant factors in intestine were(TAs), bioaccessible As in stomach and(TP), followed by pH of soil samples,(TAl) and(TOM). The bioaccessible As in stomach was decreased due to the addition of pepsin while no significant change was observed by adding typsin to the digestive solution in intestine. The bioaccessibility of As reached the peaks at the pH 0.9 and 5.0 in stomach and intestine respectively and approach the maximum levels relatively stable by about 1.0h and 4.0h of extraction in stomach and intestine respectively. Therefore, digestion simulations for 1.0h in stomach fluid at pH 0.9 and for 4.0h in intestine fluid at pH 5.0 were recommended for As bioaccessibility measurement. The study also indicates that it is of great significance to further developing the bioaccessibility method based on the characteristics of Chinese gastrointestinal digestion.

As；bioaccessibility；medical formula；gastrointestinal digestion；controlling factors

X53

A

1000-6923(2019)01-0235-08

鄭 瑞(1992-),女,山西陽泉人,首都師范大學碩士研究生,主要從事土壤重金屬生物有效性研究.發(fā)表論文3篇.

2018-05-30

北京市科委創(chuàng)新基地專項(Z161100005016022);北京市自然科學基金資助項目(8164055);中央專項資金-土壤污染防治技術研發(fā)與示范項目

* 責任作者, 姜林, 研究員, jianglin@cee.cn; 鐘茂生, 副研究員, zhongmaosheng@126.com