種植材料表面納米級(jí)形貌對(duì)細(xì)胞成骨效應(yīng)的影響

蔡彥坤 祁星穎 綜述 隋磊 審校

材料表面的形態(tài)特征是影響種植體骨整合效果的重要因素，適當(dāng)粗糙表面較之光滑表面更有利于骨整合的形成［1］。目前應(yīng)用于臨床的種植體表面多具有微米級(jí)形貌，有利于細(xì)胞成骨向分化，但可能抑制成骨細(xì)胞增殖，影響種植體表面成骨速度［2］。納米級(jí)形貌是指至少在一個(gè)維度上尺寸為納米級(jí)水平的顯微形貌。采用酸蝕［3］、陽(yáng)極氧化［4-6］、堿熱、水熱［7］、電子束刻蝕［8］等方法可在材料表面獲得具有不同幾何形態(tài)的納米級(jí)形貌，常見(jiàn)者包括納米管［9-10］、納米結(jié)節(jié)［11］、納米球［12］、納米凹坑［13］、納米溝槽［14］等。這些納米級(jí)形貌或單獨(dú)存在，或與微米級(jí)形貌形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，都會(huì)對(duì)組織細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其對(duì)材料表面成骨具有促進(jìn)作用［1，15-16］。

本文綜述種植材料表面納米級(jí)形貌對(duì)細(xì)胞成骨效應(yīng)的影響及其機(jī)制，以期為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及后期臨床轉(zhuǎn)化提供線索。

1 細(xì)胞黏附

一般認(rèn)為，納米級(jí)形貌對(duì)細(xì)胞成骨效應(yīng)的影響機(jī)制在于其對(duì)早期蛋白吸附、細(xì)胞粘附及后續(xù)的細(xì)胞伸展、增殖、分化等一系列生物學(xué)行為的調(diào)控。其中，整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附是納米級(jí)形貌產(chǎn)生作用的最重要環(huán)節(jié)。整合素是由α和β亞單位鏈構(gòu)成的跨膜受體，直徑約為8～12 nm，其細(xì)胞內(nèi)部分通過(guò)多種銜接蛋白（talin，vinculin，paxillin等）與肌動(dòng)蛋白絲相連，并通過(guò)肌動(dòng)蛋白絲與細(xì)胞核實(shí)現(xiàn)連接［17-18］。當(dāng)細(xì)胞與具有納米級(jí)結(jié)構(gòu)的材料表面接觸時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)首先與材料表面發(fā)生反應(yīng)，其中的蛋白質(zhì)通過(guò)靜電引力吸附于納米結(jié)構(gòu)表面［19］，這些蛋白質(zhì)的RGD序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列）作為配體，可以與整合素發(fā)生特異性結(jié)合［17］。細(xì)胞的絲狀偽足表面含有整合素，在絲狀偽足伸出并感知細(xì)胞所處環(huán)境、收集空間信息的過(guò)程中，其上的整合素與吸附于納米級(jí)形貌表面的RGD蛋白相結(jié)合，形成包含RGD蛋白、整合素、銜接蛋白以及肌動(dòng)蛋白絲在內(nèi)的超分子復(fù)合體，即黏著斑（focal adhesion，F(xiàn)A）。黏著斑的形成使細(xì)胞偽足錨定在粘附位點(diǎn)上。當(dāng)黏著斑數(shù)量較多且間距適宜時(shí)，在肌動(dòng)蛋白絲的牽引下相互連結(jié)聚合，形成更大更成熟的黏著斑復(fù)合物（直徑約為2～5μm）［18］，促進(jìn)細(xì)胞的粘附。研究表明，單個(gè)RGD配體間距約70 nm時(shí)，有利于整合素受體與配體結(jié)合并聚集［20-21］，即有利于黏著斑復(fù)合物形成。黏著斑聚合的同時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲亦聚合成束，促使細(xì)胞骨架重組，為細(xì)胞在材料表面的伸展提供動(dòng)力基礎(chǔ)。在整合素-RGD蛋白發(fā)生結(jié)合的同時(shí)，整合素構(gòu)象發(fā)生改變，會(huì)激活與之連接的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）。FAK是一種酪氨酸激酶，在胞漿內(nèi)通過(guò)整合素銜接蛋白與黏著斑共存，并與多種信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)聯(lián)。當(dāng)整合素構(gòu)象因納米及形貌的作用而發(fā)生改變時(shí)，與其相連的FAK上某些位點(diǎn)（如Tyr397位點(diǎn)）會(huì)發(fā)生自動(dòng)磷酸化，并與Src蛋白結(jié)合形成FAK-Src復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游信號(hào)通路。FAK的激活可調(diào)控Rac1表達(dá)升高，有利于細(xì)胞板狀偽足的形成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的錨定；同時(shí)還可激活Rho-GTPase（主要為RhoA），使肌球蛋白收縮，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，為細(xì)胞伸展提供有利條件［22］。

2 細(xì)胞增殖

當(dāng)細(xì)胞粘附在納米級(jí)形貌表面后，即開(kāi)始增殖活動(dòng)。納米級(jí)形貌對(duì)細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)可能與其表面吸附的蛋白、FAK信號(hào)通路及細(xì)胞間相互作用有關(guān)。①吸附蛋白：細(xì)胞通過(guò)表面吸附蛋白的介導(dǎo)粘附于材料表面，實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞增殖能力與吸附蛋白的數(shù)量呈正相關(guān)［7］。此外，吸附于納米結(jié)構(gòu)表面的蛋白可能因納米級(jí)形貌的不同而改變蛋白構(gòu)象，繼而影響整合素的結(jié)合及不同亞基的激活，從而調(diào)控細(xì)胞增殖［23］；②FAK相關(guān)信號(hào)通路：FAK的激活是細(xì)胞粘附后調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的重要環(huán)節(jié)［24］，一方面，F(xiàn)AK的激活對(duì)其下游信號(hào)通路RhoA-ROCK的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［25］；另一方面，F(xiàn)AK-Src形成復(fù)合物后產(chǎn)生SH2結(jié)構(gòu)域，與接頭蛋白結(jié)合，再與Ras中的交換因子結(jié)合，從而激活Ras-Raf-MAPK／ERK通路，經(jīng)過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)將表面形貌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)促分裂原蛋白活化激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的作用促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖［26-27］；③細(xì)胞間相互作用：細(xì)胞間相互作用時(shí)的信號(hào)傳遞主要由跨膜結(jié)構(gòu)神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）完成，其對(duì)細(xì)胞增殖具有重要作用。在具有納米結(jié)構(gòu)的表面上，形狀伸展的細(xì)胞較在光滑表面上類(lèi)圓形的細(xì)胞需要更多的N-cadherin生成來(lái)維持細(xì)胞間的粘附，因而N-cadherin呈現(xiàn)高表達(dá)［28］。而N-cadherin能激活Ca2+通道，使與之相連的鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）激活，進(jìn)而激活MAPK通路。

3 細(xì)胞分化

納米級(jí)形貌對(duì)干細(xì)胞成骨向分化的調(diào)控機(jī)制目前尚不完全清楚?，F(xiàn)有研究報(bào)道因所采用的納米級(jí)形貌的形態(tài)不同、細(xì)胞分化水平不同以及所觀察的信號(hào)通路不同，導(dǎo)致結(jié)論存在很多爭(zhēng)議。一般認(rèn)為，納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞成骨向分化的促進(jìn)作用主要通過(guò)細(xì)胞骨架對(duì)機(jī)械力的傳導(dǎo)以及整合素相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩方面實(shí)現(xiàn)。

細(xì)胞骨架對(duì)機(jī)械力的傳導(dǎo)是目前本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。當(dāng)細(xì)胞粘附于納米級(jí)粗糙表面時(shí)，較之在光滑表面上具有更伸展的形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)部相應(yīng)產(chǎn)生一定的張力，繼而細(xì)胞骨架發(fā)生重組，以維持其形態(tài)的穩(wěn)定。在此過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了一系列機(jī)械信號(hào)和生物化學(xué)信號(hào)變化，主要包括：①細(xì)胞核形狀變化：細(xì)胞骨架通過(guò)整合素與細(xì)胞外基質(zhì)相連，連接細(xì)胞膜與核膜，又通過(guò)LINC復(fù)合體（linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton complexes）與細(xì)胞核骨架（nucleoskeleton）相連，使細(xì)胞作為一個(gè)整體感受外界機(jī)械力的變化。細(xì)胞骨架重組、張力增加，使細(xì)胞核的形狀發(fā)生改變，細(xì)胞核骨架亦發(fā)生重組，進(jìn)而在染色質(zhì)重組酶的介導(dǎo)下使染色質(zhì)重組［29］，染色質(zhì)重組過(guò)程中，某些轉(zhuǎn)錄因子被激活，進(jìn)而上調(diào)了成骨向分化相關(guān)基因的表達(dá)；②與細(xì)胞骨架相連的細(xì)胞因子被激活：細(xì)胞形態(tài)對(duì)YAP（yes-associated protein）等與細(xì)胞骨架相連的細(xì)胞因子在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)的分布有直接影響，有研究表明，細(xì)胞骨架的收縮和重組會(huì)抑制YAP在細(xì)胞質(zhì)中的磷酸化，有利于YAP從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。其入核后與RunX2等成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化［30］；③鈣離子通道：細(xì)胞內(nèi)張力增加可能直接使?fàn)繌埣せ钚訡a2+通道開(kāi)放，Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，激活CaM，CaM不僅可以激活MAPK通路，還可以與β連環(huán)素（β-catenin）結(jié)合，使肌動(dòng)蛋白收縮，細(xì)胞骨架重組［31］，進(jìn)而激活前述信號(hào)通路。

整合素相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是納米級(jí)形貌調(diào)控細(xì)胞成骨向分化的另一重要機(jī)制。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始環(huán)節(jié)主要包括FAK和整合素連接激酶（integrin linked kinase，ILK）的激活。①FAK的激活：FAK磷酸化可激活相關(guān)下游信號(hào)通路，如RhoA-ROCK通路［32］、MAPK通路等，促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)基因ALP、RunX2、OCN、OPN等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的成骨向分化；②ILK的激活：ILK與整合素β亞基的細(xì)胞內(nèi)部分相連。在納米級(jí)形貌表面，整合素-RGD蛋白結(jié)合會(huì)改變整合素的構(gòu)型，使 β1亞基選擇性激活并高表達(dá)［3，33-34］，進(jìn)而激活I(lǐng)LK，而被激活的ILK可抑制GSK-3β的表達(dá)及GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化，使細(xì)胞質(zhì)中游離的β-catenin不被降解，且逐漸在細(xì)胞質(zhì)中積聚進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中與RunX2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并表達(dá)［35］，促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化［28，34］。

綜上所述，細(xì)胞對(duì)納米級(jí)粗糙表面的粘附是納米級(jí)形貌發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞成骨效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其對(duì)細(xì)胞增殖、分化的影響均與整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附及伸展密切相關(guān)，當(dāng)材料表面的微觀形貌利于整合素的聚集時(shí)，則有利于細(xì)胞的粘附，并為后續(xù)的細(xì)胞增殖、成骨向分化、細(xì)胞外基質(zhì)礦化及骨組織成熟奠定良好基礎(chǔ)；反之則細(xì)胞成骨效應(yīng)不佳。因此可以認(rèn)為細(xì)胞粘附是種植材料表面骨形成的前提和基礎(chǔ)。然而，因不同實(shí)驗(yàn)間納米級(jí)形貌特征、細(xì)胞種類(lèi)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的差異，現(xiàn)有研究結(jié)果可比性尚存疑問(wèn)。未來(lái)研究可采用激光處理等手段獲得精確可控的納米級(jí)表面形貌，排除混雜因素，更精準(zhǔn)地了解特定納米級(jí)形貌對(duì)細(xì)胞城固效應(yīng)的影響及其機(jī)制，以期篩選出有利于成骨的最佳微觀形貌，推動(dòng)種植體體表面設(shè)計(jì)的更新迭代。