脂肪干細胞在宮腔粘連中的應(yīng)用進展及前景

吳琳 申東翔 張慧蓉 羅敏南方醫(yī)科大學研究生院（廣州5055）；南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（廣州5000）

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）是指子宮腔內(nèi)異常增生纖維組織、瘢痕組織填充的表現(xiàn)［1］。子宮內(nèi)膜正常的組織結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外分為致密層、海綿層和基底層，宮腔粘連的發(fā)生與正常內(nèi)膜組織被破壞密切相關(guān)。其中妊娠期刮宮、宮內(nèi)感染、子宮多發(fā)性息肉剔除術(shù)等其他子宮內(nèi)手術(shù)操作后都可能導致宮腔粘連［2］。從而在臨床上出現(xiàn)繼發(fā)性絕經(jīng)、習慣性流產(chǎn)等。目前，手術(shù)后給予新型透明質(zhì)酸鈉凝膠等可降低遲發(fā)性流產(chǎn)刮宮術(shù)后發(fā)生宮腔粘連的風險［3］，治療方法主要有超聲引導下壓力灌注法，IUA分離術(shù)及宮腔鏡下的IUA 分離術(shù)（TCRA）［4］。目前，治療IUA 主要手段為IUA 松解術(shù)聯(lián)合雌激素療法。這種療法對輕型宮腔粘連患者有較好的療效，但不能很好地解決重度IUA 患者的內(nèi)膜再生問題。轉(zhuǎn)化醫(yī)學的興起為重度宮腔粘連提供了新思路，即利用細胞多向分化能力將某種干細胞誘導分化為子宮內(nèi)膜細胞，修復子宮內(nèi)膜形態(tài)，達到恢復月經(jīng)來潮、成功妊娠的目的。國內(nèi)外已有相關(guān)研究開展，故目前使用干細胞治療或者預防宮腔粘連的實驗大多處于動物實驗階段，僅有少數(shù)發(fā)展至臨床試驗階段［5-7］。脂肪干細胞具有取材方便，創(chuàng)傷小，來源豐富，規(guī)避倫理問題的特點，已有大量脂肪干細胞的轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究就此開展。鑒于脂肪干細胞的提取、培養(yǎng)及誘導方法及相關(guān)分子機制已有相關(guān)研究，故應(yīng)用脂肪干細胞治療難治性宮腔粘連具有現(xiàn)實意義及可行性，故本文將對脂肪干細胞用于治療宮腔粘連的前景進行綜述。

1 宮腔粘連病理及病因

1.1 病理宮腔粘連病理表現(xiàn)為其中子宮內(nèi)膜纖維化，即基質(zhì)大部分被纖維組織和腺體所取代，被不活動的立方柱狀子宮內(nèi)膜上皮所取代；功能層和基底層難以區(qū)分，功能層被上皮單層取代；荷爾蒙刺激低反應(yīng)和纖維化粘連并且跨腔成形［8］?？傊?，宮腔粘連就是子宮內(nèi)膜失去正常的組織結(jié)構(gòu)，從而被纖維組織、單層上皮所取代。由此可與宮腔粘連病因產(chǎn)生聯(lián)系。

1.2 病因剖宮產(chǎn)術(shù)后的胚胎殘留物負壓吸引術(shù)是宮腔粘連形成的重要危險因素［9］；HOOKER 等［10-11］通過系統(tǒng)綜述和Mete 分析及臨床多中心前瞻性隨機試驗得出流產(chǎn)后每五名婦女中就有一例患有IUA，其中一半以上的患者粘連的程度輕微，臨床意義不明，復發(fā)性流產(chǎn)和妊娠期刮宮手術(shù)被確定為粘連形成的危險因素，可能與妊娠期后體內(nèi)雌孕激素水平驟降子宮內(nèi)膜較薄從而致內(nèi)膜損傷；開腹子宮肌瘤切除術(shù)是宮內(nèi)粘連形成的一個重要但目前未被重視的病因，作為開腹子宮肌瘤切除的替代治療方法--經(jīng)陰道超聲引導下的射頻溶解—具有令人鼓舞的療效和安全性，提示并發(fā)癥發(fā)生率低。但和DING 等［12］發(fā)現(xiàn)了一例經(jīng)陰道超聲引導射頻溶解后右中腔子宮壁從前面到后面形成的宮腔粘連，術(shù)后可能損傷子宮內(nèi)膜基底層甚至子宮平滑肌層，后期瘢痕修復纖維增生形成粘連；盆腔放療后造成子宮宮腔粘連的概率約為0.05%，然而，由于未來放射治療骨盆惡性疾病的更廣泛應(yīng)用，這個數(shù)字可能會增加［8］?？傊?，任何損傷子宮內(nèi)膜到達基底層的治療方法或者病理變化都可能導致宮腔粘連。

2 宮腔粘連的治療與干細胞

根據(jù)宮腔粘連的嚴重程度，臨床癥狀不一，較輕的患者臨床癥狀相應(yīng)較輕甚至無明顯癥狀，對生育能力影響不大，而中重型患者出現(xiàn)繼發(fā)性絕經(jīng)、反復流產(chǎn)等，對于有生育訴求的患者來說，是導致不孕的重要因素。因此，從最初源頭上預防宮腔粘連、治療改善內(nèi)膜粘連狀況，恢復子宮內(nèi)膜正常月經(jīng)來潮周期及胚胎著床發(fā)育條件是越來越多醫(yī)學工作者面臨的難題。超聲引導下壓力灌注法（pressure lavage under ultrasound guidance，PLUG），TCRA 及宮腔鏡下的TCRA 等外科治療方法是目前常用的治療方法，預防宮腔粘連方面有研究證明術(shù)后透皮雌激素凝膠和口服阿司匹林聯(lián)合治療可能通過增加子宮血和血管生成來增強子宮內(nèi)膜容受性，從而有助于改善生育預后［13］。另目前CAI 等［14］基于結(jié)合了人造生物相容性材料GelMA 和天然多糖材料海藻酸鈉特征的微流體液滴模板的新型載藥多孔支架，獲得了符合子宮腔形狀的多孔支架，并且在宮腔粘連的大鼠模型中測試了該系統(tǒng)，證明該系統(tǒng)具有促進新血管形成，使受損組織細胞化和修復子宮內(nèi)膜的能力。但是這些方法對于恢復子宮內(nèi)膜正常結(jié)構(gòu)意義不明顯［15-16］。故干細胞的多向分化潛能為重建子宮內(nèi)膜正常結(jié)構(gòu)提供了可能。

目前，多種干細胞用于子宮內(nèi)膜再生的研究，如CAO等［5］運用臍帶間充質(zhì)干細胞進行膠原支架治療復發(fā)性子宮粘連患者的同種異體細胞療法提示經(jīng)過臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療宮腔粘連后，子宮內(nèi)膜重新獲得增殖與再生能力；JU 等［6］將小鼠骨髓干細胞移植到宮腔粘連小鼠動物模型中，發(fā)現(xiàn)模型小鼠中子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量并降低了纖維化面積率，同時雌激素受體與孕激素受體表達水平上調(diào)，并且得出骨髓干細胞移植到宮腔粘連模型中可能通過促進ER 和PR 表達來有效修復受損的子宮內(nèi)膜；CABANILLAS 等［7］運用來自體外周血CD133+骨髓來源干細胞通過導管插入立即輸入子宮螺旋動脈中治療宮腔粘連及子宮內(nèi)膜萎縮患者。2 個月后，所有患者內(nèi)膜厚度增加，前3 個月成熟血管密度增加和月經(jīng)的持續(xù)時間和強度較治療前改善，此外，還妊娠方面結(jié)果也有一定改善。

目前，使用干細胞治療或者預防宮腔粘連的實驗大多處于動物實驗階段，僅有少數(shù)發(fā)展至臨床試驗階段，動物實驗結(jié)論如何運用至人體實驗，且如何優(yōu)化臨床試驗方式，從而提高患者月經(jīng)正常、妊娠成功比例是未來科研努力的方向。在目前進行的干細胞治療宮腔粘連的研究中，干細胞移植到宮腔后，分泌抗纖維化細胞因子可以改善宮腔內(nèi)粘連情況，對于子宮內(nèi)膜修復意義深遠，表明運用干細胞治療宮腔粘連具有可行性；在干細胞的選擇上，應(yīng)盡量選擇與子宮內(nèi)膜細胞相同胚胎來源的干細胞種類，如同來源于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細胞，但是由于骨髓穿刺術(shù)獲取骨髓干細胞的方式相對獲取的骨髓干細胞數(shù)量有限，而脂肪干細胞屬于間充質(zhì)干細胞的一種，同樣來源于中胚層，從體內(nèi)獲取方便且數(shù)量豐富，與此同時，也有將脂肪干細胞運用于骨再生、周圍神經(jīng)再生等方面的研究，對于其獲取、培養(yǎng)、誘導等方面有一定的經(jīng)驗可以借鑒，故而將脂肪干細胞運用于宮腔粘連治療具有可行性與創(chuàng)新性。

3 脂肪干細胞

3.1 概述脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）屬于成體干細胞，是一種間充質(zhì)干細胞，胚胎來源為中胚層，在人體組織中主要分布在脂肪組織中，ADSCs 的典型或者特異性細胞標記為：CD90（+）、CD73（+）、CD105（+），同時CD45（-）、CD34（-）［17］。在細胞治療及組織工程中脂肪干細胞是最有優(yōu)勢的成體干細胞［18］，原因有如下幾點：（1）脂肪干細胞來源豐富，取材方便。皮下脂肪豐富，并且可在行抽脂術(shù)的同時留取作為副產(chǎn)品的脂肪組織，且對機體損傷小，與此同時可分離得到充足的脂肪干細胞［19］，從同樣重量的脂肪和骨髓中分離到的干細胞數(shù)量，脂肪干細胞約為骨髓干細胞的500 倍［18］；（2）增殖能力強于骨髓間充質(zhì)干細胞，生長因子分泌能力及免疫能力強于其他干細胞，如血管內(nèi)皮生長因子-D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D），胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）及白介素-8（interleukin-8 ，IL-8）［20］；（3）脂肪干細胞可從患者自身取材［20］，同時避免異體細胞，胚胎干細胞治療倫理問題。

3.2 ADSCs 的獲取、分離及培養(yǎng)脂肪干細胞的提取在已經(jīng)有很多嘗試，目前國際上公認的簡便、有效、經(jīng)濟的提取方式為脂肪抽吸術(shù)，此時選擇合適的供體部位至關(guān)重要，有研究表明供體不同部位的脂肪干細胞活力概況差別不大，但就相同體積分離得到的脂肪干細胞產(chǎn)量而言，大腿外側(cè)明顯高于腹部、腰部和膝蓋經(jīng)研究了供體年齡對ASCs 增殖潛能和分化多能性的內(nèi)部；與此同時，研究者還發(fā)現(xiàn)新鮮提取的脂肪干細胞與經(jīng)過培養(yǎng)后的脂肪干細胞在細胞表型及細胞動力學檢測表現(xiàn)出微小差異，因此得出兩種脂肪干細胞可能表現(xiàn)出相同的生存能力［17］。另外通常認為脂肪干細胞的功能隨著年齡而下降，盡管一些研究已研究了供體年齡對脂肪干細胞增殖潛能和多能性的影響，但這些研究的結(jié)果并不一致。HASEGAWA 等［21］的研究分析表明，脂肪形成潛能隨著年齡的增長而下降，但細胞增殖能力、成骨和軟骨形成潛能與年齡無關(guān)，并且在包括脂肪生成在內(nèi)的所有脂肪干細胞分化潛能中，觀察到個體差異，主成分分析（PCA）顯示，老年人的個體差異變得明顯（60 歲以上），這些變異在女性中比在男性中更為突出（女性超過60 歲，男性超過80 歲）。

從獲取的脂肪組織中分理處脂肪干細胞的具體方法大致如下，如BACAKOVA 等［18］可通過脂肪抽吸術(shù)獲得脂肪干細胞，獲得的脂肪組織在經(jīng)過磷酸鹽緩沖鹽水的反復漂洗至緩沖鹽水干凈后，再將其切碎呈約0.3 cm × 0.3 cm 顆粒狀［22］；將標本轉(zhuǎn)移至添加0.75%Ⅰ型膠原酶的磷酸鹽緩沖鹽水中，在37 ℃環(huán)境中靜放60 min；然后再以800 r/min速度離心5 min，離心后，上清液為脂肪細胞懸液，沉淀為脂肪源性基質(zhì)血管部分。然后棄去上清液，保留沉淀部分［23］。沉淀部分包含有多種細胞，如內(nèi)皮細胞、免疫細胞、平滑肌細胞、干細胞和其他基質(zhì)細胞。接下來將沉淀部分在此懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中再利用80 μm 尼龍篩網(wǎng)過濾，分離組織碎片，然后以8 000 r/min 速度離心10 min。保留離心后的細胞懸液，并將細胞懸液加入添加了10%胎牛血清、40 μg/mL 濃度的慶大霉素和5 ng/mL 濃度的成纖維細胞生長因子的DMEM（dulbecco's modified eagle's minimum essential medium）培養(yǎng)基中，再將培養(yǎng)基放置在溫度為37 ℃，5%CO2環(huán)境中。待細胞長滿培養(yǎng)基約80%面積時，加入含有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）磷酸鹽緩沖鹽溶液5 min［18］。其某些細節(jié)有差別，如ROXBURGH等［22］在研究中采用的Ⅰ型膠原蛋白酶濃度為0.075%，獲得脂肪源性基質(zhì)血管部分時的離心速度為2 000 r/min。

在ADSCs 培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的選擇各個實驗室也均有不同，但是其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的是10%胎牛血清，另生長因子可以影響ASCs 的未分化狀態(tài)，故在體外條件下，干細胞表型可能受到生長培養(yǎng)基類型，培養(yǎng)基特定補充物及生長環(huán)境條件的影響［20］。還有研究表明細胞培養(yǎng)中常用的抗生素的存在對ADSC 的表型不是完全中性的，它們有調(diào)節(jié)分化過程的作用［24］。因此在常規(guī)細胞培養(yǎng)過程中添加抗生素中醫(yī)防止培養(yǎng)基被污染的步驟需要謹慎選擇是否添加入脂肪干細胞培養(yǎng)基中。根據(jù)其分化方向所采用的培養(yǎng)基會有所差別，但目前諸多研究報告得出富含血小板PRP［25］能明顯促進脂肪來源干細胞生長及增殖，增強其成脂活性及能力，但是其具體機制尚不明確［26］。上述的脂肪干細胞提取、分離、培養(yǎng)方法均為體外實驗的方法，而且在每個過程中都有可能會影響脂肪干細胞的增殖和分化能力，從供體年齡、供體部位到培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)環(huán)境等，因此，在此步驟中應(yīng)當在標準操作基礎(chǔ)上進一步根據(jù)相關(guān)的實驗目的來選擇適合適的方法。脂肪干細胞在經(jīng)過分離、培養(yǎng)后可以正常生長，但是在后續(xù)的實驗過程中，如何長期保持其增殖及分化能力，在經(jīng)過長期的傳代培養(yǎng)過程中，可能出現(xiàn)的細胞衰老凋亡現(xiàn)象該如何避免呢，根據(jù)相應(yīng)的實驗目的，到底是選擇新鮮分離得到的脂肪干細胞還是經(jīng)過培養(yǎng)后的干細胞，這些問題在研究過程中都應(yīng)該經(jīng)過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計來驗證解決。

3.3 ADSCs 的增殖與分化脂肪干細胞是一種成體干細胞，保留了增殖能力及多向分化潛能，脂肪干細胞可通過相應(yīng)的誘導因素分化成成骨細胞［27-29］、血管平滑肌細胞［30］、骨骼肌樣細胞［31］及神經(jīng)施旺細胞［32-34］，其具體機制不明確，誘導因素如何確定，主要與誘導方向細胞的體內(nèi)周圍環(huán)境有關(guān)，通過調(diào)整培養(yǎng)基硬度、培養(yǎng)基添加細胞因子種類、物理刺激類型（電刺激、微波刺激、超聲波刺激）來創(chuàng)造合適的誘導條件［18］。在體內(nèi)實驗中，脂肪干細胞移植到動物模型中的方法大概有3 種，靜脈注射、原位移植或復合膠原支架材料等，其中干細胞與膠原支架是再生醫(yī)學的重要兩元素，膠原支架可以為干細胞提供三維的空間，利于干細胞的遷移和生長，而不影響干細胞的干性相關(guān)基因的表達［35］。此外，在生物工程方面，WANG 等［36］開發(fā)了一種生物工程三維膀胱貼片，由多孔支架和多層脂肪干細胞片組成，并在膀胱損傷的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)此貼片可促進尿路上皮再生，平滑肌、神經(jīng)細胞和膀胱血管再生。

目前，脂肪干細胞用于治療或者預防宮腔粘連的研究文獻有限，其中在孔德勝［35］的研究中將體外培養(yǎng)的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因（GFP-ASCs）大鼠來源的脂肪間充質(zhì)干細胞通過原位移植或復合小腸黏膜下基質(zhì)（SIS）等方式移植，觀察子宮膜修復的病理形態(tài)學變化、容受性改善及GFP-ASCs 對修復的影響SIS 復合或不復合ASCs 移植后，均可明顯改善子宮內(nèi)膜病理形態(tài)學指標，減少纖維化，促進內(nèi)膜生長，提高內(nèi)膜容受性，改善妊娠情況，但以SIS 復合ASCs效果更佳。SUN等［37］運用大鼠脂肪干細胞移植到大鼠子宮內(nèi)，一些脂肪干細胞在子宮內(nèi)直接分化成具有新生血管生成的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，而其他表達雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）并在后續(xù)妊娠中胚胎能夠成功著床在移植宮角部位?？蛇M一步驗證小鼠是否能夠成功受孕并生產(chǎn)，同時設(shè)立對照組，排除其他干擾因素。

4 總結(jié)

臨床上宮腔粘連患者在無癥狀或者無生育訴求時，通常不會選擇治療該疾病，但是當某些中重度宮腔粘連患者出現(xiàn)腹痛或者有強烈生育訴求時，減少子宮內(nèi)膜纖維化，促進內(nèi)膜生長，提高內(nèi)膜容受性，改善妊娠情況就成為臨床工作者努力的方向，而運用自體脂肪干細胞移植到子宮內(nèi)治療宮腔粘連從理論上而言是可行的。同時女性生育期的年齡也不會明顯影響脂肪干細胞的增殖及分化能力。脂肪干細胞無論從取材便利性、操作可行性、倫理道德性來說，都是目前治療中重度宮腔粘連，實現(xiàn)月經(jīng)恢復正常、妊娠過程正常的最佳選擇。但是目前脂肪干細胞誘導呈子宮內(nèi)膜細胞尚缺乏統(tǒng)一、嚴謹、有效的試驗方法，并且其中的分子機制尚不明確，有待進一步詳細研究。