miRNA 在干燥綜合征中的研究進(jìn)展

陳敏 李文倩 李棟 沈括

1青海大學(xué)研究生院（西寧810007）；2青海省人民醫(yī)院（西寧810007）

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）是一種影響外分泌腺和多器官系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病。其前期主要累及淚腺及唾液腺等外分泌腺，腺體功能障礙后可出現(xiàn)口干、眼干等不適［1］，后期加重可累及呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)以及肝脾等器官［2-3］。SS 的致病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前對(duì)其病因尚無法明確闡明。病毒感染可成為其始動(dòng)因素之一，主要病理特點(diǎn)為外分泌腺中B 細(xì)胞過度激活，成熟聚集形成異位生發(fā)中心，引發(fā)自身免疫［4］。同時(shí)臨床研究發(fā)現(xiàn)SS 也與雌激素緊密相關(guān)［5］。雖然目前抗SSA 和抗SSB 抗體已經(jīng)納入SS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其特異性和敏感性欠佳［6］，且SS 的臨床癥狀類似于其他免疫病，導(dǎo)致SS 容易漏診和誤診。為了進(jìn)一步探索SS 的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)標(biāo)志物，國內(nèi)外開始進(jìn)一步深入研究調(diào)控SS 的相關(guān)因素，在一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)及其他免疫病研究中發(fā)現(xiàn)，某些miRNA 不但可能與SS 發(fā)病機(jī)制中病毒感染、B 淋巴細(xì)胞、自身抗原、雌激素等方面有關(guān)聯(lián)，而且在SS 與其他免疫性疾病間的鑒別也具有一定的作用［7-8］，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)SS 的研究指明了新的方向。通過研究表明miRNA 是高度保守的小非編碼RNA 分子，它可以通過與mRNA 的3′非翻譯區(qū)域互補(bǔ)序列結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA 的降解和翻譯抑制，進(jìn)而可調(diào)控SS 不同階段的演化。本文綜述了近年來miRNA 在SS 中的研究進(jìn)展。

1 miRNA 的合成和作用機(jī)制

miRNA 是非編碼RNA 的分子之一。它們廣泛存在于動(dòng)植物及病毒中。通常，miRNA 基因在細(xì)胞核中經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）的催化作用轉(zhuǎn)錄得到初始miRNA（pri-miRNA），長度大約為300～1 000 nt，pri-miRNA經(jīng)過Drosha 酶處理后，成為前體miRNA（pre-miRNA），長度大約為70～90 nt，為一莖環(huán)結(jié)構(gòu)；pre-miRNA 再經(jīng)過Dicer酶處理后，成為長約20～24 nt 的成熟miRNA［9］。但是目前尚不知新生的miRNA 是如何免受核糖核酸酶清除的，如單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1 可以降解miRNA，避免miRNA 的產(chǎn)生［10］。miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解和翻譯影響mRNA 基因的表達(dá)，幾乎調(diào)控所有的生理及病理過程。2002年CALIN 等［11］發(fā)現(xiàn)miR-15/miR-16 在人慢性淋巴瘤中表達(dá)下調(diào)，首次將miRNA 的研究與人類疾病相關(guān)聯(lián)。此后miRNA 的研究在多種疾病領(lǐng)域廣泛開展。近年來在免疫性疾病領(lǐng)域中，越來越多的miRNA 被研究發(fā)現(xiàn)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［12］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［13］、SS［4］、系統(tǒng)性硬化癥［14］、銀屑病［15］等疾病的發(fā)病機(jī)制。miRNA 在SS中研究剛剛起步，miRNA 可能調(diào)節(jié)SS 的病理演化，但研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)miRNA 具有多個(gè)靶點(diǎn)，與mRNA 形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［16］，這決定了miRNA 錯(cuò)綜復(fù)雜的功能，及對(duì)SS 復(fù)雜的調(diào)控方式。

2 miRNA 在SS 中的作用

2.1 病毒miRNA 與SS 病毒感染能導(dǎo)致SS 發(fā)生已經(jīng)成為共識(shí)。近年來發(fā)現(xiàn)病毒miRNA 的入侵可以成為pSS 發(fā)生的始動(dòng)因素主要在兩方面。一方面，病毒miRNA 直接侵入免疫細(xì)胞和靶器官［17］影響靶細(xì)胞膜上的相關(guān)通道功能。GALLO 等［18］研究發(fā)現(xiàn)EBV-miR-BART13-3p 在pSS 患者唾液腺中顯著差異表達(dá)，并通過實(shí)時(shí)定量PCR 證實(shí)在獨(dú)立樣本中EBV-miR-BART13-3p 上調(diào)可達(dá)22 倍以上，通過RNA22 和RNA 混合算法預(yù)測識(shí)別EBV-miR-BART13-3p 在唾液腺分泌功能相關(guān)基因mRNA 上的靶點(diǎn)，在這些功能相關(guān)基因中，基質(zhì)間分子1（stromal interacting molecule 1，STIM1）和水通道蛋白5（aquaporin5，AQP5）脫穎而出。STIM1 蛋白可通過感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度的改變，將信號(hào)傳遞到胞質(zhì)后，最終激活細(xì)胞膜上的鈣離子通道，鈣離子內(nèi)流是觸發(fā)腺體分泌的必要因素，而STIM1 蛋白的活性降低將影響鈣離子進(jìn)入腺體細(xì)胞，導(dǎo)致外分泌腺功能障礙［19］。AQP5 是位于人唾液腺腺泡細(xì)胞頂膜上的一種重要的水通道，據(jù)國外相關(guān)研究顯示AQP5 的異常分布與唾液腺的功能減退明顯相關(guān)［20］。他們預(yù)測EBV-miR-BART13-3p 的兩個(gè)靶點(diǎn)在STIM1 的3′UTR 端，一個(gè)在編碼序列，一個(gè)靶點(diǎn)在AQP5 的3′UTR 端，在體外試驗(yàn)中通過熒光素酶質(zhì)粒建立和熒光素酶報(bào)告分析得到驗(yàn)證。為了進(jìn)一步明確EBV-miR-BART13-3p 在pSS 中的確切作用，通過PCR 及Western blot 發(fā) 現(xiàn)EBV-miR-BART13-3p 導(dǎo) 致STIM1 蛋 白 翻譯抑制而不降低STIM1 的轉(zhuǎn)錄本。由于STIM1 是SOCE 的主要調(diào)控器，Ca2+通過SOCE 內(nèi)流需要活化T 細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T，NFAT），為了評(píng)估EBV-miRBART13-3p 誘導(dǎo)的STIM1 和SOCE 減少是否是影響了NFAT 的激活，研究人員通過將帶有EBV-miR-BART13-3p的GFP-NFAT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到唾液腺中后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的唾液腺中NFAT 激活減少，這說明EBV-miR-BART13-3p 誘導(dǎo)STIM1 下調(diào)導(dǎo)致SOCE 及相關(guān)Ca2+內(nèi)流依賴基因表達(dá)中斷。并且，GALLO 等通過使用LNA 穩(wěn)定的mlRNA 探針進(jìn)行了原位雜交，發(fā)現(xiàn)EBV-miR-BART13-3p 主要存在于在腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞中，特別是那些被炎癥細(xì)胞包圍的細(xì)胞。但EBV-miR-BART13-3p 由EBV 編碼，通常在被病毒感染的細(xì)胞中檢測到，而EBV 在慢性期間的潛在感染的主要靶點(diǎn)是B 淋巴細(xì)胞。GALLO 等［18］通過唾液腺上皮細(xì)胞與EBV 感染的B 淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)EBV-miR-bart13-3p 可以通過外泌體從B 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到唾液上皮細(xì)胞，最終下調(diào)STIM1 蛋白的活性。但EBV-miR-bart13-3p 如何下調(diào)AQP5的表達(dá)目前尚不清楚，因此，進(jìn)一步明確EBV-miR-bart13-3p 對(duì)AQP5 的調(diào)節(jié)機(jī)制，可作為新的研究思路，干預(yù)此過程可能對(duì)SS 的臨床癥狀有明顯緩解作用。

另一方面，病毒miRNA 入侵可促進(jìn)宿主B 淋巴細(xì)胞固有的miRNA 上調(diào)。COTRIM 等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-181a 在B 細(xì)胞遭受EBV-miRNA 入侵后上調(diào)，引發(fā)了病毒miRNA 驅(qū)使宿主miRNA 的差異表達(dá)的一種猜想。miRNA-181a 可促進(jìn)B細(xì)胞增殖，抑制CD8+T 細(xì)胞。而有相關(guān)報(bào)道m(xù)iR-181a 的高表達(dá)可以抑制正常小鼠中CD4+T 淋巴細(xì)胞的凋亡［22］。以上表明病毒miRNA 可能不止直接作用于靶腺細(xì)胞，還可通過與宿主miRNA 建立某種聯(lián)系，繼而使宿主miRNA 差異表達(dá)間接在SS 中起作用，但具體通過某種機(jī)制建立聯(lián)系尚不清楚。

2.2 miRNA 對(duì)B 淋巴細(xì)胞的功能 SS 的免疫病理形成過程中，顯著特點(diǎn)為B 淋巴細(xì)胞過度激活，在受影響的外分泌腺中形成生發(fā)中心，產(chǎn)生特異性抗體，進(jìn)而出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)，CHEN 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-223-5p、miR-150-5p、miR-155-5p 和miR-342-3p 的表達(dá)水平與外周血單個(gè)核細(xì)胞中的B細(xì)胞比例有關(guān)。近年進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在B 淋巴細(xì)胞的增殖、活化、凋亡、功能等方面具有明顯作用。

脂多糖刺激及EB 病毒感染B 淋巴細(xì)胞后導(dǎo)致miRNA-146a 在免疫紊亂的患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SS［23-24］｛Srivastava，2017 #309；Elsayed，2016 #310；Gauna，2015 #311｝｛Gauna，2015 #311；Elsayed，2016 #312；Srivastava，2017 #313｝。這種miRNA 的有效靶點(diǎn)包括干擾素調(diào)節(jié)因子5、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1 和白介素1受體相關(guān)激酶，且與SS 的基因變異或DNA 甲基化有關(guān)［25］。在一項(xiàng)構(gòu)建了一株高表達(dá)miRNA-146a 的轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-146a 直接靶向B 細(xì)胞表面Fas 蛋白，減弱Fas 凋亡作用，從而促進(jìn)B 細(xì)胞擴(kuò)增［25］。另一方面發(fā)現(xiàn)miR-146a 可抑制唾液腺細(xì)胞上共刺激分子CD80 表達(dá)下調(diào)，增高共刺激分子CD86：CD80 的比例［24］。CD80 和CD86為表達(dá)在未成熟B 細(xì)胞表面的黏附分子，CD80 為B 細(xì)胞增殖提供負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)，CD86 可增強(qiáng)B 細(xì)胞的成熟促進(jìn)B 細(xì)胞的增殖，二者的比例對(duì)B 細(xì)胞的增殖和成熟起異常關(guān)鍵的作用［26］。這說明了miRNA-146a 可促進(jìn)B 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)擴(kuò)張。通過檢測miRNA-146a 可為SS 早期診斷提供依據(jù)，通過干預(yù)中間調(diào)節(jié)過程為治療SS 提供了新的方向。

2018年，WANG-RENAULT 等［27］進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用磁珠分選法將CD4+T 淋巴細(xì)胞和CD19+B 淋巴細(xì)胞從單個(gè)核細(xì)胞中分選純化，并研究兩種細(xì)胞中miRNA 的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，has-let-7d-3p、has-miR-155-5p、has-miR-378a-3p 等在CD4+T 淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)，has-miR-378a-3p、has-miR-30b-5p、has-miR-26a-5p 等在CD19+B 淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)。且發(fā)現(xiàn)CD19+B 淋巴細(xì)胞中，has-miR-30b-5p與B 細(xì)胞激活因子（B lymphocyte stimulator，BAFF）-mRNA負(fù)相關(guān)，功能試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，當(dāng)has-miR-30b-5p 抑制后BAFF 上調(diào)。BAFF 為B 淋巴細(xì)胞表面的活化因子，在B 細(xì)胞的增殖、激活、殺傷作用方面有關(guān)鍵作用，而miRNA 通過靶向BAFF mRNA 的3′UTR［28］來調(diào)節(jié)BAFF 的表達(dá)，從而降低B 淋巴細(xì)胞活化增生［8］。BAFF 抑制后可減少唾液腺損害，減低自身抗體滴度［29］。

近期研究發(fā)現(xiàn)在SS 患者腺體組織中miR-150-5p 表達(dá)降低，通過進(jìn)一步研究表明miR-150-5p 與促進(jìn)B 細(xì)胞的分化與激活，增加B 細(xì)胞在單個(gè)核細(xì)胞中的比例有關(guān)［8］。故miR-150-5p 在SS 腺體中的低表達(dá)可能減弱B 淋巴細(xì)胞的增殖作用，這對(duì)減緩SS 的病理演化可能有一定的意義。

綜上所述，SS 的演化可能與兩大類作用相反的miRNA的平衡失調(diào)有關(guān)，促進(jìn)B 細(xì)胞激活類miRNA 高表達(dá)可加速pSS 進(jìn)程，而抑制B 細(xì)胞活化增生的miRNA 可減緩病情演化及臨床癥狀，但都需要進(jìn)一步深入研究去探索miRNA相互間的關(guān)系，以及調(diào)控機(jī)制。

2.3 miRNA 對(duì)雌激素受體的調(diào)節(jié)作用 既往對(duì)miRNA 差異表達(dá)的研究多停留在單個(gè)核細(xì)胞中，WANG-RENAULT等［27］通過進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)首次對(duì)單個(gè)核細(xì)胞中的T、B 淋巴細(xì)胞進(jìn)行純化后發(fā)現(xiàn)hsa-miR-378a-3p，hsa-miR-222-3p在pSS 患者B 淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)。近年有學(xué)者在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-378a-3p 在乳腺癌組織中的表達(dá)下調(diào)，此外miR-378a-3p 的低表達(dá)與他莫昔芬治療的乳腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)，推測miR-378a-3p 可能與雌激素相關(guān)受體表達(dá)及敏感性有關(guān)［30］。同樣在乳腺癌組織中，雌激素受體陰性表達(dá)的乳腺癌組織中miR-222 表達(dá)明顯高于雌激素受體陽性的癌組織中，并且miR-222 參與他莫昔芬抵抗，故可推測miR-222 可能參與雌激素受體的負(fù)性調(diào)節(jié)［31］。而經(jīng)過臨床研究SS 更年期女性多發(fā)，與雌激素降低緊密相關(guān)［5］。hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-222-3p 都可能負(fù)性調(diào)節(jié)雌激素受體，而導(dǎo)致機(jī)體對(duì)雌激素不敏感，導(dǎo)致雌激素水平相對(duì)不足，而構(gòu)成SS 的發(fā)病因素之一。通過研究miRNA 與雌激素的關(guān)系可為研究SS 發(fā)病原因提供新的思路。

2.4 miRNA 對(duì)SS 相關(guān)抗原Ro/SSA 和La/SSB 間的關(guān)系 組織高表達(dá)Ro/SSA 和La/SSB 自身抗體對(duì)于SS 自身免疫系統(tǒng)體液免疫的產(chǎn)生和持續(xù)至關(guān)重要?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為SSA/Ro 分為Ro52 和Ro60 兩種 多肽分子，而Ro52 是TRIM蛋白家族成員（TRIM 21），而Ro60 為TROVER 蛋白成員（TOVER 2）。GOURZI 等［32］發(fā)現(xiàn)，在小唾液腺中，let7b、miR-16、miR-181a、miR-223 和miR-483-5p 與Ro52/TRIM21mRNA 正相關(guān)。在長期培養(yǎng)的唾液腺細(xì)胞中miR-181a和miR-200b-3p與Ro52/TRIM21和Ro60/TROVE2mRNA負(fù)相關(guān)。Let7b、miR-200b-5p 和miR-223 與La/SSBmRNA 相關(guān)。YING 等［33］發(fā)現(xiàn)miR-1207-5p、miR-4695-3p 下調(diào)可導(dǎo)致唾液腺TRIM21 升高。LIANG 等［34］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SSB 可通過識(shí)別pre-miRNA 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)并結(jié)合后可以保護(hù)pre-miRNA免受核酸酶，這意味著pSS 相關(guān)自身抗原可以結(jié)合相關(guān)miRNA，減緩miRNA 的降解，二者協(xié)同可推進(jìn)SS 的演變。

雖然實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的與SSA、SSB 相關(guān)miRNA 逐漸增多，但大多局限在表達(dá)水平，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確相互關(guān)聯(lián)及調(diào)節(jié)過程的級(jí)聯(lián)方式，為SS 的治療提供新的可能。

3 miRNA 在SS 與其他免疫性疾病中的鑒別作用

pSS 由于臨床表現(xiàn)的多樣性，導(dǎo)致誤診率和漏診率較高。近年來發(fā)現(xiàn)，一些在pSS 中特異性表達(dá)的miRNA 有助于pSS 與其他免疫性疾病的鑒別。2017年，SUN 等［35］訪問了Pubmed、萬方、知網(wǎng)、維普等數(shù)據(jù)庫，采用95%置信區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)差，通過建立隨機(jī)效應(yīng)模型研究miRNA-146a 表達(dá)與兩種疾病的關(guān)系，在Meta 分析中總共包括了6 項(xiàng)研究，其中158 例病例和124 例對(duì)照。Meta 分析結(jié)果顯示miRNA-146a 表達(dá)與pSS 的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而與SLE 風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。同時(shí)SLE 亞群分析（外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清）證實(shí)了這一結(jié)果。因此，miRNA-146a 可以作為一種用于診斷pSS 的新型生物學(xué)標(biāo)志。同年，CHEN 等［8］第一次對(duì)兩種自身免疫性疾病之間的miRNA 表達(dá)譜的變化進(jìn)行了研究，他們?cè)赟LE患者中有135 種，而在pSS 患者中有26 種miRNAs 表達(dá)改變，雖然許多miRNA 在二者中表達(dá)有重疊，如miR-146 a、miR-16、miR-21 在內(nèi)的25 個(gè)miRNAs 在pSS 與SLE 中均呈高表達(dá)，但是發(fā)現(xiàn)miR-150-5p 在pSS 中下調(diào)，在SLE 中上升表達(dá)，這是pSS 中一個(gè)新穎而獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)。除此之外，幾種miRNAs 在SLE 中過度表達(dá)卻在pSS 中沒有變化，如miR-148a-3p、miR-152、miR-155、miR-223、miR-224、miR-326 和miR-342。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于SS 與其他自身免疫性疾病的鑒別提供了一個(gè)新的可選擇方法。

4 展望

SS 涉及的致病機(jī)制紛繁復(fù)雜，miRNA 調(diào)控涉及SS 病程的多個(gè)過程，且由于一個(gè)miRNA 可調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)這種特殊的調(diào)控方式，一旦找到某種涉及多方面調(diào)控SS致病過程的關(guān)鍵miRNA，對(duì)其進(jìn)行靶向藥物治療后，極有可能對(duì)SS 的臨床癥緩解有顯著效果。隨著對(duì)miRNA 的差異表達(dá)水平及相關(guān)性深入研究增多，必然會(huì)進(jìn)一步揭示相關(guān)miRNA 的功能及調(diào)控方式。這對(duì)于早期診斷、疾病鑒別、預(yù)后等具有重要意義，甚至特效靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)都將成為可能。