外泌體miR-155調(diào)控p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路影響心腎綜合征大鼠的心腎細(xì)胞凋亡

歐陽(yáng)過(guò) 蔡虎志 王雅樂 王 敏 劉越美 陳新宇

心腎綜合征(CRS)是指心臟或腎臟急慢性功能異常引起另一器官的急性或慢性功能障礙的臨床綜合征。心臟和腎臟疾病均為臨床常見病，且二者經(jīng)常同時(shí)存在，相互影響，這顯著增加了患者的死亡率，CRS近年來(lái)逐漸被重視。由于CRS的病理機(jī)制尚未完全明確，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的防治方案。綜合前期研究和文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，我們發(fā)現(xiàn)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)通路在CRS的進(jìn)展中起著重要作用，本研究基于外泌體miR-155調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路影響CRS大鼠的心腎細(xì)胞凋亡探討其發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)通路在心腎細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，外泌體miR-155可能對(duì)p38MAPK信號(hào)通路有著調(diào)控作用。

材料方法

動(dòng)物與藥品清潔級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，合格證號(hào)：43004700049940。注射用鹽酸多柔比星(阿霉素)，深圳萬(wàn)樂藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1804E1，規(guī)格10 mg/瓶。

主要試劑大鼠N端前腦鈉素ELISA試劑盒(上海希美化學(xué)有限公司，貨號(hào)：CSB-E08752r)；人腎損傷分子1(KIM-1)ELISA 試劑盒(上海希美化學(xué)有限公司，貨號(hào)：CSB-E08808r)；Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：KGA704)；兔多克隆p38MAPK抗體(美國(guó)proteintech，貨號(hào)：14064-1-AP)；兔多克隆p-p38抗體(CST公司，貨號(hào)：#9211)；小鼠單克隆β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(美國(guó)proteintech，貨號(hào)：60008-1-Ig)；Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸(美國(guó)Sigma)；GAPDH、P38引物(上海生工)；RIPA裂解液(中國(guó)北京普利萊)；蛋白酶抑制劑(德國(guó)Merck)；蛋白磷酸酶抑制劑(瑞士Roche)；SuperECL Plus 超敏發(fā)光液(美國(guó)Thermo pierce)；上樣緩沖液6X(上海碧云天)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì))；Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture(北京康為世紀(jì))；SYBRGREEN I核酸染料(北京普博欣生物)；血清外泌體提取試劑盒(SBI公司，貨號(hào)：01.SBI.EXOQ5TM-1)；外泌體定量試劑盒(Biovision公司，貨號(hào)：K120-1-100)。

主要儀器超聲彩色多普勒診斷儀(深圳市開立科技有限公司，型號(hào)：S2N)；-80℃冰箱(中科美菱，DW-HL388)；包埋機(jī)(常州中威電子儀器，BMJ-A)；振蕩切片機(jī)(萊卡，VT1000S)；多功能顯微鏡和數(shù)字圖像分析儀(Motic，BA410B)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀，H1650R)；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)(匯松，PW-812)；多功能酶標(biāo)分析儀(匯松，MB-530)；恒溫培養(yǎng)箱(光明，DHP-500)；電泳儀(美國(guó)Bio-rad，164-5050)；轉(zhuǎn)膜儀(北京六一，DYCZ-40A)；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(英國(guó)Syngene G公司)；熒光PCR板(Thermo，SPL0960)；熒光定量RCP儀(Thermo，PIKO REAL 96)；透射電子顯微鏡(日立，7700型)；數(shù)碼相機(jī)(AMT，ER-B)。

實(shí)驗(yàn)分組清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250g，在自由飲食、光暗周期為12h/12h、溫度22℃～26℃條件下正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。按體質(zhì)量分層，再隨機(jī)分為空白組、造模3周組、造模4周組、造模5周組、造模6周組，每組10只。

造模方法與標(biāo)本采集用生理鹽水將阿霉素配置成質(zhì)量濃度2.0 mg/ml的溶液，以1.5 ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,每周注射1次,分別連續(xù)注射3周、4周、5周、6周。

分別于造模3周、4周、5周、6周后行心臟超聲檢測(cè)，隨后靜脈采血，實(shí)驗(yàn)?zāi)⒋笫筇幩廊⌒呐K、腎臟。

指標(biāo)檢測(cè)

心臟超聲檢測(cè) 大鼠腹腔麻醉后，平臥位固定，剔除胸毛，涂耦合劑，將探頭置于左胸前，調(diào)節(jié)探頭至左心室短軸切面，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)。

血清氨基末端腦鈉肽前體(NT-pro BNP)和KIM-1檢測(cè) 取大鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

血清肌酐、尿素氮測(cè)定 采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清尿素氮和肌酐含量。

血漿外泌體提取及電鏡觀察外泌體形態(tài) 采用美國(guó)SBI公司的外泌體提取試劑盒EXOQuick(EXOQ5A-1)抽提血漿中的外泌體，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書操作。收集外泌體，以備后續(xù)miR-155、CD9的檢測(cè)。電鏡觀察外泌體形態(tài)及直徑。

外泌體定量檢測(cè) 具體步驟參照美國(guó)Biovision 公司ExoQuantTMOverall Exosome Capture and Quantification ELISA Assay Kit (Human Plasma,Colorimetric)說(shuō)明書進(jìn)行。

RT-PCR法檢測(cè)大鼠心臟、腎臟p38MAPK mRNA、miR155及外泌體miR-155的表達(dá) 具體步驟參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)如表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)法引物設(shè)計(jì)

p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶

Western Blot法檢測(cè)大鼠心臟及腎臟p38MAPK、p-p38MAPK、外泌體CD9蛋白的表達(dá) 具體步驟參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

HE染色觀察腎臟病理形態(tài)學(xué) 取腎臟固定、脫水、包埋、切片、染色、封片后，光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

TUNEL法檢測(cè)大鼠心、腎細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率 參照Tunel試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。每張切片取3個(gè)高倍視野，采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件計(jì)算每張切片凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率，取平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用《SPSS 22.0》統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多樣本計(jì)量資料比較符合正態(tài)性和方差齊性時(shí)用單因素方差分析檢驗(yàn)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)性和方差齊性用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

結(jié) 果

一般情況造模組大鼠逐漸出現(xiàn)腹水、脫毛、毛發(fā)干燥枯黃、活動(dòng)量減少、飲食減少等現(xiàn)象，其中造模6周組1只大鼠死亡，可見腹腔注射部位潰爛。

大鼠心腎功能指標(biāo)與空白組比較，4周組、5周組、6周組大鼠EF、FS值降低(P<0.01)，4周組大鼠血清NT-proBNP升高(P<0.05)，5周組、6周組大鼠血清NT-proBNP升高(P<0.01)(表2)。

與空白組比較，4周組大鼠血清肌酐(SCr)升高(P<0.05)，5周組、6周組大鼠血清尿素氮(BUN)升高(P<0.01)，4周組、5周組、6周組大鼠SCr升高(P<0.01)； 5周組、6周組大鼠血清KIM-1升高(P<0.01)。

表2 心臟超聲EF、FS值、血清NT-proBNP、肌酐、尿素氮、腎損傷分子1(KIM-1)濃度

EF:射血分?jǐn)?shù);FS:短軸縮短率;NT-proBNP:氨基末端腦鈉肽前體;KIM-1:腎損傷分子1；與空白組比較，△：P<0.05，△△：P<0.01

大鼠血漿外泌體含量、外泌體miR-155相對(duì)表達(dá)量及外泌體標(biāo)志蛋白CD9的表達(dá)與空白組比較，造模 4周組、5周組、6周組大鼠血漿外泌體含量降低(P<0.01)，造模3周組、4周組、5周組、6周組外泌體miR-155相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.01)(表3，圖1)。

表3 血漿外泌體定量及外泌體miR-155表達(dá)

△：與空白組比較，P<0.01

大鼠心臟、腎臟p38MAPK、p-p38MAPK、p38MAPKmRNA、miR-155的表達(dá)心臟組織中，與空白組比較，4周組、5周組p-p38MAPK增高(P<0.05)，6周組p-p38MAPK增高(P<0.01)，4周組p38MAPK mRNA增高(P<0.05)，5周組、6周組p38MAPK mRNA增高(P<0.01)。

腎臟組織中，與空白組比較，5周組p38MAPK增高(P<0.05)、6周組p38MAPK增高(P<0.01)，4周組、5周組、6周組p-p38MAPK、p38MAPK mRNA增高(P<0.01)。

與空白組比較，造模3周組、4周組、5周組、6周組心肌組織、腎臟組織miR-155相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(P<0.01)(表4，圖2)。

圖1 電鏡觀察外泌體為直徑<100 nm的圓形囊泡，Western Blot法檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9呈陽(yáng)性

組別空白組(n=10)3周組(n=10)4周組(n=10)5周組(n=10)6周組(n=9)心p38MAPK0.65±0.030.67±0.020.65±0.020.61±0.110.67±0.03心p-p38MAPK0.03±0.010.09±0.030.14±0.04△0.15±0.02△0.26±0.03△△心p38MAPK mRNA0.19±0.040.48±0.100.58±0.08△0.74±0.12△△0.83±0.14△△心臟miR-1553.56±0.301.76±0.19△△1.58±0.16△△1.32±0.08△△1.02±0.03△△腎p38MAPK0.56±0.190.55±0.560.55±0.460.65±0.64△0.67±0.02△△腎p-p38MAPK0.03±0.010.08±0.020.11±0.02△△0.14±0.02△△0.24±0.06△△腎p38MAPK mRNA0.25±0.040.74±0.100.88±0.20△△1.06±0.17△△1.11±0.25△△腎臟miR-1553.89±0.171.75±0.08△△1.07±0.12△△0.73±0.03△△0.95±0.05△△

p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；p-p38MAPK:磷酸化p38MAPK；與空白組比較，△：P<0.05，△△：P<0.01

圖2 各組大鼠心臟及腎臟p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)情況p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；β-actin:β肌動(dòng)蛋白

大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察及心、腎細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率空白組、造模3周大鼠腎小球、腎小管、腎小囊腔結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理學(xué)改變。造模4周組大鼠腎小球體積輕微增大，腎小球及腎間質(zhì)可見紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞有輕度變性。造模5周組大鼠腎小球、腎小管、腎小囊腔形態(tài)改變，可見紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球硬化，部分腎小管萎縮，管腔變窄，腎間質(zhì)纖維化。造模6周組大鼠可見部分腎小球形態(tài)異常，結(jié)構(gòu)不完整，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死,可見條紋狀纖維化。

腎臟HE染色圖片中，造模后可見部分腎組織紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)構(gòu)改變、腎間質(zhì)纖維化等病理改變(3A)。

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖片中，腎臟切片腎小球和腎小管均可見不同程度核染成棕黃色或褐色陽(yáng)性染色(3B)。心臟各組均可見心肌細(xì)胞不同程度核染成棕黃色或褐色陽(yáng)性染色(3C)。

圖3 各組大鼠腎臟HE染色和TUNEL法檢測(cè)心臟、腎臟細(xì)胞凋亡圖片(×400)

與空白組比較3周組、4周組、5周組、6周組心臟、腎臟凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率增高(P<0.01)(表5)。

表5 心臟、腎臟凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率

△：與空白組比較，P<0.01

討 論

既往研究證實(shí)，CRS的發(fā)生主要與下列因素有關(guān)：(1)腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)激活[1]；(2)交感神經(jīng)系統(tǒng)活化[2]；(3)慢性炎癥反應(yīng)[3-4]等。在上述因素作用下均可引起心肌細(xì)胞和腎臟細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是損傷心臟結(jié)構(gòu)和功能的主要途徑[5]，同時(shí)腎臟足細(xì)胞凋亡也是腎單位丟失的主要途徑[6-7]。課題組前期研究已證實(shí)MAPK信號(hào)通路中的主要亞族p38MAPK通路蛋白磷酸化的表達(dá)與CHF病情進(jìn)展呈正相關(guān)[8]。另有研究證實(shí)，p38MAPK磷酸化在足細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的腎功能損傷中起著關(guān)鍵作用，抑制p38磷酸化，能降低心腎細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)CRS大鼠心腎功能[9]。由此可知，p38MAPK介導(dǎo)的心腎細(xì)胞凋亡在CRS進(jìn)展中有著重要作用。

本研究也證實(shí)，p-p38MAPK的表達(dá)量與心腎細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，p-p38MAPK的表達(dá)量與心腎功能呈負(fù)相關(guān)，這與前期研究報(bào)告基本相符。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)血漿外泌體含量、外泌體miR-155表達(dá)量、心腎組織miR-155表達(dá)量與p-p38MAPK表達(dá)量、心腎細(xì)胞凋亡率、心腎功能呈負(fù)相關(guān)，而血漿外泌體含量、外泌體miR-155表達(dá)量與心腎組織miR-155表達(dá)量呈正相關(guān)，這表明miR-155可能對(duì)p-p38MAPK的表達(dá)有抑制作用，且心腎組織miR-155表達(dá)量的增多可能是通過(guò)外泌體攜帶miR-155來(lái)調(diào)節(jié)。

研究證實(shí)，作為p38MAPK上游非編碼調(diào)控基因，miR-155可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶10途徑調(diào)控促分裂原活化蛋白激酶3(MKK-3)及MKK-6，從而影響p38MAPK介導(dǎo)系列生物活性反應(yīng)[10-11]。同時(shí)，作為重要的細(xì)胞間信號(hào)物質(zhì)運(yùn)載體——外泌體，幾乎可被所有的細(xì)胞主動(dòng)分泌，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁[12-13]。由于外泌體可以從細(xì)胞內(nèi)攜帶miRNAs及其他生物活性物質(zhì)分泌到細(xì)胞間質(zhì)中而介導(dǎo)著細(xì)胞的自分泌、旁分泌及功能物質(zhì)的遠(yuǎn)端傳遞作用，近三年來(lái)逐漸受到各領(lǐng)域研究者的高度重視[14-15]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們得出結(jié)論：p38MAPK磷酸化在心腎細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，且外泌體miR-155可能對(duì)其有著重要的調(diào)控作用。

鑒于CRS病理機(jī)制的復(fù)雜性，本研究從外泌體miR-155調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路影響心腎細(xì)胞凋亡出發(fā)，研究其可能的病理機(jī)制，這對(duì)CRS的防治有著重要意義，可能成為未來(lái)治療的靶點(diǎn)。