基于生物信息學(xué)方法探討Her-2基因表達(dá)對胃癌免疫細(xì)胞浸潤的影響

張靜 游路寬 胡毅

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，超過2/3的患者確診時已屬晚期，預(yù)后不佳［1］。據(jù)報道，8%～53%的胃癌與人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）蛋白過表達(dá)有關(guān)［2］。Her-2是由ERBB2基因編碼的ERBB家族受體重要成員之一，可與其他家族成員結(jié)合形成異源二聚體，通過激活下游RAS-RAF-MEK-ERK通路或PI3KAKT-mTOR通路向細(xì)胞傳遞增殖和存活信號。當(dāng)細(xì)胞Her-2過表達(dá)或功能增加時，可向下游傳遞過多細(xì)胞增殖信號，從而導(dǎo)致腫瘤形成［3］。此外，Her-2還可激活血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體VEGFR的啟動子，增加 VEGF和VEGFR蛋白表達(dá)與釋放，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移［4-5］。此外，以往有研究發(fā)現(xiàn)Her-2抑制劑可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤，同時依賴免疫調(diào)節(jié)作用而發(fā)揮抗癌作用［6］。近期國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)Her-2或通過抑制cGAS-STING通路抑制腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［7］。本研究通過生物信息學(xué)方法分析人類癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的胃癌相關(guān)數(shù)據(jù)，在基因水平探討Her-2對胃癌免疫微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤的潛在影響，為后續(xù)研究Her-2與胃癌關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

胃癌數(shù)據(jù)來源于TCGA。以“Stomach adenocarcinoma”為關(guān)鍵詞，從癌癥數(shù)據(jù)共享（GDC）網(wǎng)站（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下載407例胃癌患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)，以及臨床信息、預(yù)后等資料，其中癌組織樣本375例，癌旁組織樣本32例。排除缺少癌旁組織樣本及臨床資料不全者，最終共納入354例胃癌患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)。同時從GEO數(shù)據(jù)庫下載30例胃癌樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的GSE36968作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。

1.2 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞評估

CIBERSORT是一種基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評估腫瘤組織中22種免疫細(xì)胞占比的計(jì)算方法，通過574個標(biāo)記基因表達(dá)值進(jìn)行反卷積，從而估算腫瘤組織中不同免疫細(xì)胞的比例［8］。本研究采用該算法計(jì)算胃癌組織中22種免疫細(xì)胞的浸潤占比，并采用R軟件（版本號3.6.0）對354例胃癌樣本進(jìn)行CIBERSORT分析，每個樣本獲得一個P值，P值＜0.05的樣本納入后續(xù)分析。以Her-2 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)（4.52）為界，將354例樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 基于特定基因標(biāo)識的功能變化分析

基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）是評估轉(zhuǎn)錄組基因集富集情況的一種非參數(shù)無監(jiān)督分析方法［9］。GSVA通過對感興趣的基因集合進(jìn)行綜合打分，將基因水平變化轉(zhuǎn)變?yōu)橥匪阶兓?，進(jìn)而判斷樣本的生物學(xué)功能。本研究從Molecular Signatures Database數(shù)據(jù)庫（v7.0版）（http：//software.broad-institute.org/gsea/msigdb）下載基因集合，采用GSVA算法對每個基因集合進(jìn)行綜合打分，評估不同樣本潛在的生物學(xué)功能變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 3.6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用秩和檢驗(yàn)分析Her-2高表達(dá)組和Her-2低表達(dá)組樣本浸潤免疫細(xì)胞占比的差異；Pearson相關(guān)分析各種免疫細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性?；贕SVA方法，采用Pearson相關(guān)系數(shù)衡量179例胃癌樣本相關(guān)基因信號通路表達(dá)與Her-2表達(dá)的關(guān)系。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIBERSORT分析結(jié)果

CIBERSORT分析結(jié)果顯示，179例胃癌樣本中靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞占比最高（16.5%），隨后占比自高到低依次為CD8+T細(xì)胞（11.1%）、幼稚B細(xì)胞（10%）、M2型巨噬細(xì)胞（8.8%）、M0型巨噬細(xì)胞（7.5%）等。見圖1A。

CIBERSORT方法評估兩組免疫細(xì)胞浸潤的情況，結(jié)果顯示179例（Her-2低表達(dá)組104例，高表達(dá)組75例）樣本的免疫細(xì)胞浸潤程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。104例Her-2低表達(dá)組和75例高表達(dá)組樣本的CD8+T細(xì)胞、靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤程度差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029，0.049，0.027，0.008），其中 CD8+T 細(xì)胞及肥大細(xì)胞在Her-2低表達(dá)組中的浸潤程度較高表達(dá)組高，而靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞和M0型巨噬細(xì)胞在Her-2低表達(dá)組中的浸潤程度低于高表達(dá)組。見圖1B。

2.2 179例胃癌樣本中免疫細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析179例胃癌樣本中22種免疫細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性，結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞、靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞等4種存在浸潤差異的免疫細(xì)胞浸潤程度具有相關(guān)性，其中CD8+T細(xì)胞與靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤程度均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.36，-0.46，-0.33），靜息狀態(tài)記憶性 CD4+T 細(xì)胞與M0型巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤程度亦均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.05，-0.19），M0型巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)（r=0.36）。見圖1C。

2.3 GSVA分析結(jié)果

通過GSVA方法對179例胃癌樣本進(jìn)行GO分析（采用GO gene sets基因集對樣本進(jìn)行打分），結(jié)果顯示Her-2基因表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞的發(fā)育、誘導(dǎo)分化、遷移調(diào)控相關(guān)，且影響這4種免疫細(xì)胞的浸潤能力和程度，見表1。KEGG分析（采用curated gene sets基因集對樣本進(jìn)行打分）Her-2基因表達(dá)可能影響179例胃癌樣本的潛在代謝通路，發(fā)現(xiàn)Her-2基因表達(dá)升高與相關(guān)腫瘤形成信號有關(guān)，見表2。

2.4 GEO數(shù)據(jù)驗(yàn)證分析結(jié)果

采用CIBERSORT算法分析GEO數(shù)據(jù)GSE36968中30例胃癌樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Her-2基因表達(dá)對腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的影響與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果基本一致。見圖2。

表1 采用GSVA進(jìn)行GO分析的結(jié)果Tab.1 Results of GO analysis using GSVA

圖1 TCGA數(shù)據(jù)的CIBERSORT分析結(jié)果Fig.1 Results of CIBERSORT analysis of TCGA data

圖2 GEO數(shù)據(jù)的CIBERSORT分析結(jié)果Fig.2 Results of CIBERSORT analysis of GEO data

表2 采用GSVA進(jìn)行KEGG分析的結(jié)果Tab.2 Results of KEGG analysis using GSVA

3 討論

機(jī)體對腫瘤產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是主要以CD8+T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞浸潤至腫瘤組織并參與腫瘤免疫循環(huán)的過程［10-11］。機(jī)體早期通過免疫監(jiān)視功能可對腫瘤進(jìn)行免疫清除，同樣腫瘤細(xì)胞也可通過免疫編輯作用抑制免疫系統(tǒng)甚至可以通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的攻擊［12-13］。隨著全球范圍內(nèi)有關(guān)胃癌Her-2研究數(shù)據(jù)及抗Her-2靶向治療經(jīng)驗(yàn)的積累，人們對Her-2在胃癌診療中的意義也有了更深刻的認(rèn)識。但既往研究大多集中于報道Her-2與腫瘤細(xì)胞生長及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，Her-2與腫瘤免疫循環(huán)的研究相對較少。近期，有研究發(fā)現(xiàn)Her-2可與STING羧基端尾部結(jié)合，同時可利用AKT1特定位置磷酸化抑制TBK1活性，阻止STING與TBK1結(jié)合而抑制抗腫瘤免疫活性，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Her-2水平及活性也可能是控制免疫感知能力和相關(guān)免疫反應(yīng)表型的決定性因素［7，14-16］。

本研究通過CIBERSORT方法分析Her-2基因低表達(dá)及高表達(dá)胃癌樣本中免疫細(xì)胞的浸潤情況，發(fā)現(xiàn)Her-2基因高表達(dá)組靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞及M0型巨噬細(xì)胞占比相對Her-2基因低表達(dá)組高，而CD8+T細(xì)胞及肥大細(xì)胞占比較Her-2基因低表達(dá)組低。機(jī)體免疫應(yīng)答包含天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，需各種細(xì)胞及因子參與。與初始T細(xì)胞相比，記憶T細(xì)胞因其表面分子已發(fā)生改變且信號傳遞在細(xì)胞內(nèi)存在差異，再次免疫應(yīng)答時記憶T細(xì)胞可更快、更易激活，從而快速高效介導(dǎo)免疫應(yīng)答［17］。在本研究中，相對于Her-2基因低表達(dá)組，Her-2基因高表達(dá)組胃癌組織中靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞較多，而CD8+T細(xì)胞在兩組中的占比則相反。該結(jié)果表明Her-2高表達(dá)的腫瘤組織，其微環(huán)境中的記憶性CD4+T細(xì)胞未被活化，且CD8+T細(xì)胞浸潤程度也明顯低于Her-2低表達(dá)的腫瘤組織。進(jìn)一步通過GSVA分析，發(fā)現(xiàn)Her-2表達(dá)程度與CD4+T細(xì)胞受體結(jié)合呈負(fù)性相關(guān)，這意味著Her-2高表達(dá)的腫瘤組織，其微環(huán)境內(nèi)的CD4+T細(xì)胞與腫瘤抗原的結(jié)合反而降低，從而導(dǎo)致靜息狀態(tài)記憶性CD4+T細(xì)胞無法活化為效應(yīng)性T細(xì)胞，減少了細(xì)胞因子（如IFN-γ及IL-4等）分泌，降低對CD8+T細(xì)胞的趨化作用，進(jìn)而導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞浸潤程度降低［18］。免疫細(xì)胞的浸潤程度相關(guān)性分析中，CD8+T細(xì)胞與靜息狀態(tài)CD4+記憶性T細(xì)胞浸潤程度呈負(fù)相關(guān)亦證實(shí)這一結(jié)果。

作為有高度可塑性的M0型巨噬細(xì)胞，在IFN-γ或細(xì)菌脂多糖的誘導(dǎo)下能活化形成M1型巨噬細(xì)胞，并釋放多種抗腫瘤細(xì)胞活化因子，同時可激活機(jī)體特異性免疫應(yīng)答。M0型巨噬細(xì)胞亦可在Th2細(xì)胞釋放的IL-4和IL-13等誘導(dǎo)活化形成M2型巨噬細(xì)胞，并釋放多種炎癥或免疫抑制分子，從而抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［19］。如前所述，在Her-2基因高表達(dá)組中，因?yàn)殪o息狀態(tài)的記憶性CD4+T細(xì)胞未能被腫瘤組織抗原“活化”，導(dǎo)致IFN-γ、IL-4及IL-13等細(xì)胞因子生成減少，從而抑制M0型巨噬細(xì)胞向其他類型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，致使腫瘤微環(huán)境中M0型巨噬細(xì)胞增高，而減少的細(xì)胞因子則降低對CD8+T細(xì)胞浸潤的趨化，這一結(jié)果在M0型巨噬細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞浸潤程度相關(guān)性分析中亦得以印證。結(jié)合GSVA的GO分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)Her-2基因高表達(dá)與巨噬細(xì)胞集落刺激因子的形成及應(yīng)答、巨噬細(xì)胞因子產(chǎn)生的負(fù)性調(diào)控以及巨噬細(xì)胞遷移的負(fù)性調(diào)控等生物學(xué)途徑均呈不同程度負(fù)相關(guān)，因此推測Her-2基因高表達(dá)可能限制了M0巨噬細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育分化。

肥大細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子和介質(zhì)，影響淋巴細(xì)胞的特異性反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié)，還參與抗原呈遞［20］。本研究中Her-2基因高表達(dá)組的肥大細(xì)胞占比較Her-2基因低表達(dá)組少，結(jié)合GSVA中GO分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Her-2基因高表達(dá)與肥大細(xì)胞分化、化學(xué)趨化因子及肥大細(xì)胞遷移呈負(fù)相關(guān)。推測可能是Her-2基因高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤組織釋放的肥大細(xì)胞趨化因子減少，從而使Her-2基因高表達(dá)的腫瘤組織中肥大細(xì)胞浸潤較少。為了驗(yàn)證TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，本研究采用GEO收錄的胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證Her-2基因表達(dá)與胃癌免疫細(xì)胞浸潤程度的關(guān)系，結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果基本一致。說明Her-2基因高表達(dá)一定程度上可抑制胃癌組織中以上抗腫瘤免疫應(yīng)答的“正面因素”。

本研究通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)胃癌中Her-2基因高表達(dá)可能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定抑制作用，進(jìn)而影響免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，但本研究僅基于生物信息學(xué)分析，有關(guān)結(jié)論仍需通過大樣本臨床研究加以驗(yàn)證。