ERCC1、TYMS和RRM1在宮頸癌組織中的表達(dá)及與化療療效的關(guān)系

周文 王佳麗 譚碧波 莫凌昭

宮頸癌是我國(guó)女性第二大常見惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢(shì)［1-2］。手術(shù)是宮頸癌最主要的治療方法，但對(duì)于存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)切緣陽(yáng)性等復(fù)發(fā)高危因素的患者，化療是重要的輔助治療手段。宮頸癌具有高度異質(zhì)性，同一化療方案不同患者療效不盡相同，而腫瘤細(xì)胞耐藥或不敏感是化療失敗的主要原因［3-4］。因此，尋找化療敏感及耐藥靶點(diǎn)，對(duì)選擇化療方案，改善預(yù)后尤為關(guān)鍵。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（nucleotide excision repair cross complementary gene1，ERCC1）和核苷酸還原酶M1（nucleotide reductase M1，RRM1）為化療耐藥基因［5］，而胸苷酸合成酶基因（thymidine synthase gene，TYMS）與化療療效密切相關(guān)［6］。本研究通過(guò)檢測(cè)與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)的ERCC1、TYMS、RRM1在宮頸癌組織中的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征及化療療效的關(guān)系，以期為化療療效和預(yù)后評(píng)估尋找新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年1月至2016年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的宮頸癌患者術(shù)后標(biāo)本33例。所有患者術(shù)前均未接受手術(shù)或放化療治療，術(shù)后采取以鉑類為主的化療方案，臨床病理及隨訪資料完整。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批，患者及家屬知情同意并簽署同意書。

1.2 治療方法

化療前所有患者均行婦科體格、血常規(guī)以及生化常規(guī)等檢查，無(wú)化療禁忌證。所有患者均采用以鉑類為主的化療方案。順鉑70 mg/m2，靜脈滴注；吉西他濱1 g/m2，靜脈滴注，d1、8，21 d 為 1 個(gè)周期，4～5 個(gè)周期。常規(guī)給予護(hù)肝、護(hù)胃、抗過(guò)敏、止吐等對(duì)癥支持治療。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)ERCC1、TYMS及RRM1 mRNA的表達(dá)

4%～10%中性福爾馬林溶液固定標(biāo)本，由廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司檢測(cè)ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA表達(dá)水平。按照AmoyDx FFPE樣品RNA分離試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，測(cè)定RNA的純度及含量，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)：94℃5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 15 s，30 個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算 ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，分別將ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA表達(dá)量超過(guò) 3.04×10-3、2.71×10-3、10.10×10-3記為陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)量低于 3.04×10-3、2.71×10-3、10.10×10-3記為陰性表達(dá)。

1.4 隨訪及療效評(píng)價(jià)

通過(guò)再次入院、門診復(fù)查、電話等隨訪方式隨訪，每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，隨訪截至2019年3月。中位隨訪時(shí)間32個(gè)月，平均30個(gè)月?？偵嫫诙x為確診至患者死亡、失訪或隨訪截止的時(shí)間?；熃Y(jié)束后依據(jù)WHO實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效，分為完全緩解（CR）：腫瘤完全消失，超過(guò)1個(gè)月；部分緩解（PR）：腫瘤最大直徑及最大垂直直徑的乘積縮小達(dá)50%，其他病變未增大，持續(xù)超過(guò)1個(gè)月；疾病穩(wěn)定（SD）：病變兩徑乘積縮小不超過(guò)50%，增大不超過(guò)25%，持續(xù)超過(guò)1個(gè)月；疾病進(jìn)展（PD）：病變兩徑乘積增大超過(guò)25%。總有效率=［（CR+PR）/總例數(shù)］×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；采用χ2檢驗(yàn)比較3個(gè)基因表達(dá)與宮頸癌化療療效的關(guān)系；采用Pearson相關(guān)分析3個(gè)基因在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1、TYMS及RRM1 mRNA表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

33例宮頸癌組織中ERCC1、TYMS、RRM1陽(yáng)性表達(dá)率分別為 78.8%（26/33）、69.7%（23/33）、75.8%（25/33）。ERCC1表達(dá)與FIGO分期、腫瘤大小、高危型HPV病毒感染、淋巴脈管癌栓、肌層浸潤(rùn)深度及鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）水平有關(guān)（P<0.05）；TYMS表達(dá)與腫瘤大小、高危型HPV病毒感染及淋巴脈管癌栓有關(guān)（P<0.05）；RRM1表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理特征均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表 1 ERCC1、TYMS、RRM1 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s，×10-3）Tab.1 Relationship between ERCC1，TYMS，RRM1 expression and clinicopathological features of cervical cancer patients（±s，×10-3）

表 1 ERCC1、TYMS、RRM1 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s，×10-3）Tab.1 Relationship between ERCC1，TYMS，RRM1 expression and clinicopathological features of cervical cancer patients（±s，×10-3）

Characteristics n ERCC1 TYMS RRM1 Expression t P Expression t P Expression t P Age(year) 0.543 0.591 0.041 0.968 1.501 0.143＜50 20 7.59±4.97 9.36±6.37 39.31±24.79≥50 13 6.69±4.13 9.26±7.87 28.08±12.89 Nationality -1.227 0.229 -0.065 0.949 -0.876 0.388 Han nationality 21 6.50±3.51 9.26±7.00 32.40±18.97 Ethnic minority 12 8.53±6.05 9.43±6.95 39.22±25.42 Menopause 0.627 0.535 -0.250 0.804 1.020 0.316 Yes 14 6.80±3.97 9.58±7.21 31.62±21.76 No 19 7.83±5.47 8.97±6.65 39.31±20.87 FIGO stage -2.113 0.043 -1.788 0.083 -0.019 0.985Ⅰ-Ⅱ 30 6.69±4.61 8.61±6.69 36.14±22.63Ⅲ-Ⅳ 3 11.65±1.34 15.77±5.20 36.40±13.27 Degree of differentiation 1.496 0.145 0.044 0.965 0.285 0.778 Poorly differentiated 23 8.01±5.14 9.36±7.22 35.59±24.79 Well differentiated 10 5.45±2.43 9.24±6.38 33.25±11.09 Pathological type 0.953 0.348 1.044 0.304 -0.506 0.616 Squamous cell carcinoma 24 7.70±5.01 10.09±6.90 33.71±20.70 Non squamous cell carcinoma 9 5.98±3.26 7.28±6.77 38.00±24.19 Tumor size（cm) 0.113 <0.001 -2.859 0.008 0.399 0.693≤4 14 3.99±2.40 5.72±6.13 36.64±27.86>4 19 9.63±4.41 11.98±6.27 33.59±15.80 Depth of invasion -2.157 0.039 -0.030 0.976 0.551 0.586≤1/2 10 4.75±2.62 9.27±6.64 38.03±18.81>1/2 23 8.32±4.91 9.35±7.12 33.51±22.70 High risk HPV -2.838 0.008 -2.512 0.017 0.819 0.419 Positive 12 8.80±4.43 11.43±6.78 32.56±14.57 Negative 21 4.51±3.66 5.64±5.55 38.94±30.32 Lymph nodes metastasis -0.223 0.825 -0.290 0.774 0.364 0.718 Yes 20 7.46±3.44 9.76±6.53 33.18±15.31 No 13 7.09±5.32 9.04±7.24 35.99±24.91 SCC-Ag(μg/L) -2.632 0.013 -0.505 0.617 -0.137 0.892≤1.5 21 5.77±3.28 8.86±7.62 34.50±23.36>1.5 12 9.80±5.57 10.13±5.55 35.57±18.44 Cancer thrombus of lymphatic vessel -2.457 0.020 -2.478 0.019 -1.256 0.218 Yes 15 8.91±4.83 11.84±6.80 39.12±22.37 No 18 5.23±3.52 6.31±5.84 29.80±19.72

2.2 宮頸癌組織中ERCC1與TYMS、RRM1表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，ERCC1 mRNA表達(dá)水平與TYMS mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.608，P=0.004），與RRM1 mRNA表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（r=0.418，P=0.152）。見表2。

2.3 ERCC1、TYMS、RRM1與宮頸癌患者化療療效的關(guān)系

33例患者均完成化療計(jì)劃，可評(píng)估療效。ERCC1、TYMS、RRM1陽(yáng)性表達(dá)組患者總有效率分別為46.2%、34.8%、44.0%，均低于陰性表達(dá)組患者的85.7%、90.0%、87.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 ERCC1、TYMS、RRM1表達(dá)水平與宮頸癌患者化療療效的關(guān)系［n（%）］Tab.3 Relationship between the expression of ERCC1，TYMS and RRM1 and the efficacy of chemotherapy in cervical cancer patients［n（%）］

2.4 ERCC1、TYMS、RRM1表達(dá)的總生存期的關(guān)系

ERCC1、TYMS、RRM1陽(yáng)性表達(dá)患者3年總生存率分別為61.5%、60.9%、56.0%，均低于陰性表達(dá)患者的 100.0%、90.0%、100.0%，但 ERCC1、TYMS、RRM1陰性表達(dá)的患者的生存曲線與陽(yáng)性患者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.404，P=0.236；χ2=0.263，P=0.608；χ2=0.236，P=0.627）。

3 討論

鉑類藥物是目前治療宮頸癌的一線化療藥物［7］。研究發(fā)現(xiàn)鉑類藥物通過(guò)與DNA結(jié)合形成Pt-DNA加合物，影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而造成腫瘤細(xì)胞的DNA損傷及細(xì)胞凋亡［8］。ERCC1是核苷酸切除修復(fù)途徑的重要組成部分，可直接影響DNA修復(fù)的生理過(guò)程［9］。研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1參與鉑類藥物耐藥的發(fā)生，其表達(dá)水平與鉑類藥物化療療效及總生存期呈負(fù)相關(guān)［10-11］。TYMS是一種葉酸依賴性酶，其編碼的胸苷酸合成酶是嘧啶核苷酸合成限速酶，也是5-FU發(fā)揮細(xì)胞毒作用的目標(biāo)酶［12］。RRM1是DNA合成與修復(fù)的限速酶，也是導(dǎo)致吉西他濱耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)［13-14］。本研究檢測(cè)33例宮頸癌組織中ERCC1、TYMS、RRM1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三者陽(yáng)性表達(dá)率依次為78.8%、69.7%、75.8%，且高表達(dá)ERCC1和TYMS的宮頸癌患者與不良臨床病理特征有關(guān)，其中兩者均高表達(dá)患者腫瘤直徑更大、感染高危型HPV病毒且有淋巴脈管癌栓，ERCC1高表達(dá)患者還與更晚的FIGO分期、更嚴(yán)重的肌層浸潤(rùn)深度、更高的SCC-Ag水平有關(guān)，Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)ERCC1與TYMS mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。ZHU等［15］研究亦發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中ERCC1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。鄭巧榮等［16］報(bào)道TYMS表達(dá)與宮頸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。說(shuō)明ERCC1和TYMS高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞浸潤(rùn)性更強(qiáng)，惡性程度更高，且可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。本研究未發(fā)現(xiàn)RRM1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，但付娟等［17］研究顯示RRM1表達(dá)與局部晚期宮頸癌患者分化程度、盆腔淋巴結(jié)腫大有關(guān)，可能與納入對(duì)象疾病程度及治療方案等不同有關(guān)。

本研究根據(jù)ERCC1、TYMS、RRM1表達(dá)分為陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)組，兩組患者均接受4～5個(gè)周期的以鉑類藥物為主的化療，進(jìn)一步觀察其近期和遠(yuǎn)期療效，發(fā)現(xiàn)三者陽(yáng)性表達(dá)的患者化療總有效率均低于陰性表達(dá)患者，3年總生存率亦均低于陰性表達(dá)患者，但是總體生存未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DU等［18］研究亦發(fā)現(xiàn)ERCC1表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者鉑類藥物化療療效及總生存期呈負(fù)相關(guān)。而RRM1低表達(dá)患者吉西他濱治療療效更顯著［19］。分析原因可能是核苷酸修復(fù)系統(tǒng)在鉑類耐藥中起重要作用，而ERCC1為核苷酸切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因，其高表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞DNA損傷后的修復(fù)能力，致使鉑類化療藥物耐藥。吉西他濱主要通過(guò)阻斷DNA的合成發(fā)揮抗癌作用，而RRM1高表達(dá)會(huì)加速DNA的合成，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱產(chǎn)生耐藥。而TYMS表達(dá)增高會(huì)導(dǎo)致胸腺嘧啶核苷及嘌呤核苷合成增強(qiáng)，加速腫瘤細(xì)胞增殖。因此，三者高表達(dá)可能加強(qiáng)了宮頸癌患者對(duì)順鉑及吉西他濱耐藥，從而降低以鉑類為主化療方案的療效。

綜上所述，ERCC1、TYMS、RRM1 高表達(dá)的宮頸癌患者侵襲性及惡性程度更高，且三者可能參與宮頸癌患者鉑類藥物的耐藥反應(yīng)，導(dǎo)致術(shù)后化療療效欠佳。ERCC1、TYMS、RRM1有望成為化療療效的評(píng)估指標(biāo)，檢測(cè)其表達(dá)可能有助于預(yù)測(cè)化療藥物敏感性和制定化療方案，提高患者化療有效率，從而改善預(yù)后。但本研究樣本數(shù)量有限，且未排除手術(shù)、化療藥物劑量等對(duì)化療療效及總生存期的影響，有關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。