16S rRNA基因檢測在假體周圍感染診斷中的應用

塔拉提百克·買買提居馬，王瑞，焦洋，劉恒，李翔，楊姍，曹永平

(北京大學第一醫(yī)院，北京 100034)

隨著人工關節(jié)置換的數(shù)量增加，關節(jié)置換術后并發(fā)癥也越來越受到人們的重視。無菌性松動(aseptic failure，AF)和假體周圍感染(prosthetic joint infection，PJI)是患者面臨關節(jié)翻修手術的兩大常見原因，但二者在臨床上卻時常較難鑒別。由于培養(yǎng)技術有限，很多不典型的PJI被誤認為是AF。研究發(fā)現(xiàn)，PJI消耗的醫(yī)療資源和費用是AF的2.8倍[1]。2010年美國骨科醫(yī)師協(xié)會有關PJI的指南指出[2]，雖然初次髖和膝關節(jié)置換術后假體周圍感染的發(fā)生率僅為1%～4%，但是一旦發(fā)生，對患者來說就是災難性的。PJI不僅增加患者痛苦，還帶來巨大經(jīng)濟負擔。PJI和AF處理原則也截然不同，區(qū)別主要在于假體再植入時機的選擇和是否有必要把整個假體都取出，因此準確診斷PJI尤為重要。目前診斷PJI的金標準是假體周圍組織或關節(jié)液中培養(yǎng)出細菌，但由于其敏感度和特異度均較低，導致相當大一部分患者漏診或誤診。近年來分子生物學方法在PJI診斷中的研究和應用越來越多，但是對其有效性和實用價值仍存爭議。本文針對16S核糖體RNA基因檢測在PJI診斷中的原理和操作流程、優(yōu)缺點和研究展望做一綜述。

1 原理和操作流程

核糖體RNA(ribosome RNA，rRNA)對絕大多數(shù)原核生物的生存必不可少，其中16S rRNA在細菌及其他微生物的進化過程中高度保守，被稱為細菌的“分子化石”。由于人體細胞中沒有16S rRNA，所以極少發(fā)生人源性污染。在16S rRNA分子中同時含有高度保守的序列區(qū)域和高度變化的序列區(qū)域，高度保守區(qū)域可以作為廣泛的探針檢測細菌，而高度變化區(qū)域可用于鑒別菌種[3]。具體方法如下：首先根據(jù)高度保守區(qū)的堿基序列設計引物，將被檢測微生物的16S rRNA基因片段進行擴增，測序獲得該基因序列，再與生物信息數(shù)據(jù)庫(如GenBank)進行比對和同源性分析，利用可變區(qū)序列的差異確定親緣關系，從而對微生物進行分類鑒別。通常認為，16S rRNA基因序列同源性小于97%，即可認為屬于不同的種；同源性小于93%～95%，可認為屬于不同的屬[3]。因此，16S rRNA在微生物臨床檢測方面，尤其是口腔科、婦產(chǎn)科、眼科等領域，用途越來越廣泛。而16S rRNA基因檢測在PJI診斷方面的應用起步比較晚，研究較少。

16S rRNA基因檢測法診斷假體周圍感染大致流程和注意事項如下：a)標本收集。所用標本一般為關節(jié)液或者假體周圍組織，至少需要3個標本。收集標本后立刻送檢實驗室。為了減少體表菌群引起的標本污染，應避免使用淺表組織標本。同時，避免拭子法取標本，因其敏感性和特異度均較低。b)超聲震蕩處理假體周圍組織標本。此步驟并非檢測必需，但經(jīng)超聲震蕩處理后的假體周圍組織裂解液敏感性和特異性均顯著高于普通假體周圍組織標本。因此一般推薦超聲震蕩處理標本，以提高檢測效率。c)基因提取。推薦自動化基因提取，從而降低交叉污染和節(jié)省人力?；蛱崛〔怀浞只蛘邼舛炔粔蚩赡軙е录訇幮?，所以應該先擴增一段人的特定基因片段來測試提取基因的質量，一般選擇人β-球蛋白基因[4]。d)基因擴增測序和分析。用BR-PCR或RT-PCR儀識別特定的16S rRNA基因片段并將其擴增，然后對擴增的片段進行基因測序。最終將檢測出的基因序列跟基因數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)對比分析鑒別菌種。

若從幾個不同患者中檢測到同一個微生物，或者檢測出的微生物為水(不動桿菌、假單胞菌)和皮膚(表皮葡萄球菌、丙酸桿菌)常見菌種時應考慮到污染可能。但是其中皮膚常見菌群有可能是污染，也有可能是假體周圍感染的致病菌。

2 研究進展

Levine等[5]在1995年首次通過PCR技術檢測到PJI相關細菌的16S rRNA基因片段，從而開辟了PJI診斷的新道路。應用通用的16S rRNA探針可以檢測包括需氧菌、厭氧菌和分歧桿菌在內的幾乎所有的原核生物[4]。據(jù)文獻報道，臨床上有明顯感染證據(jù)的患者中僅有7%～39%的患者術后培養(yǎng)是陰性的，但16S rRNA基因測序能夠檢測出上述培養(yǎng)陰性標本中的細菌DNA[6]。

一般認為術前抗生素的應用和難養(yǎng)菌是導致培養(yǎng)陽性率低的可能原因，除此之外更重要的原因是假體周圍常見病原菌往往在假體表面形成生物膜，從而進一步降低培養(yǎng)陽性率。跟游離細菌相比，由于生物膜內細菌運動性能降低，其新陳代謝和增殖會加快[7]。除此之外，生物膜不僅可以保護病原體免受抗生素和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，還可以降低膜外細菌濃度，從而影響傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)陽性率[8]。Stoodley等[9]用掃描電鏡或激光聚焦掃描顯微鏡證明了生物膜的存在。超聲裂解法可以破壞生物膜從而釋放更多病原體，因此可以提高病原體檢出率。Rak等[10]對86例髖膝關節(jié)翻修患者的假體周圍組織及其超聲裂解液進行16S rRNA基因檢測，結果顯示未經(jīng)超聲處理的假體周圍組織檢測敏感性和特異性分別為76%和93%，經(jīng)超聲震蕩處理的假體周圍組織裂解液檢測敏感性和特異性分別為95%和97%，從而首次用較大樣本進行分子生物學方法證實超聲裂解法能夠提高假體周圍感染檢測的特異性和敏感性。因此臨床上針對培養(yǎng)陰性的患者推薦超聲震蕩處理標本后再進行病原體檢測。

Cazanave等[11]報道近期用過抗生素的患者標本中16S rRNA基因檢測陽性率要顯著高于培養(yǎng)陽性率。2014年Bémer等[12]在法國的一項多中心、大規(guī)模臨床試驗中通過16S rRNA基因檢測發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬是最常見的假體周圍感染致病菌(占56%)，其中表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌比重幾乎相等。鏈球菌占10%、丙酸桿菌占7%、芽孢桿菌占8%、混合感染占15%。

最近分子生物學方法在PJI診斷方面研究比較多，新技術也比較多。近期有研究表明通過分子生物學方法檢測細菌特異性的耐藥基因來對所檢測致病菌進行藥敏試驗，比如mecA基因[13]。還有文獻報道可以通過定量PCR來估算假體周圍多重感染患者每一種病原體的細菌負荷[14]，但是目前該方法有效性仍需進一步驗證。

3 優(yōu)缺點和優(yōu)化方案

16S rRNA基因檢測可以彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)敏感性低的不足，尤其對于術前用過抗生素和難養(yǎng)細菌感染患者。但是其檢測過程清潔要求高，很容易引起交叉污染，從而影響試驗結果的可靠性。其原因包括：a)樣品收集、運送過程中體表菌群和外界環(huán)境微生物的污染。b)基因提取過程中試管、移液管、實驗員的手和衣物等均有可能造成交叉污染。c)基因擴增過程中也有可能受上一次擴增產(chǎn)物的交叉污染。盡管嚴格按照規(guī)定進行試驗、一次性應用試管、移液管、水和反應物等，仍然徹底消除不了交叉污染。建議為了避免污染菌在試驗過程中增殖，推薦使用無營養(yǎng)的生理鹽水或者乳酸鈉林格液[15]。分析試驗結果時應考慮到污染的可能性，跟常見假體周圍細菌對比，對最終結果進行綜合取舍。

使用通用引物對16S rRNA基因進行檢測的測序和對比分析過程很繁瑣也很昂貴。而使用病原體特異性引物，檢測細菌范圍會受限，不屬于引物分類單元的病原體會被漏檢。新一代的焦磷酸測序法可以實現(xiàn)大規(guī)模、平行、快速、更精確的測序，并且成本也比傳統(tǒng)的基因測序低[16]。16S rRNA基因檢測另外一個缺點就是無法進行有效的藥敏試驗，但是隨著藥敏基因數(shù)據(jù)庫的完善，分子生物學方法檢測微生物的藥敏也不再是個問題。

跟BR-PCR相比，病原特異性PCR具有更加快速、簡便、可重復、可量化、敏感性更高等特點[17]，但是每次只能檢測一種或者一類病原體。Bergin等[18]在一個樣本量為64的研究中發(fā)現(xiàn)逆轉錄PCR(RT-PCR)診斷準確率為94%，明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)和BR-PCR。RT-PCR更重要的優(yōu)點是僅能夠檢測活的微生物，因此假陽性率低于BR-PCR。分子生物學方法的應用發(fā)現(xiàn)了很多難養(yǎng)菌，例如大芬戈爾德菌、惠普爾養(yǎng)障體、結核分歧桿菌和其他分歧桿菌[19]。除此之外，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法很難發(fā)現(xiàn)混合感染，因為優(yōu)勢菌群會抑制其他菌群，而生物分子學方法能夠準確檢測每個微生物的基因片段，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)培養(yǎng)不易發(fā)現(xiàn)的菌種。

針對假體周圍感染目前大多數(shù)骨科醫(yī)師都謹慎地選擇二期翻修手術，其原因是細菌根除的不確定性。同時也有不少手術醫(yī)師提倡一期翻修術，他們認為徹底、廣泛的軟組織和生物膜清除可以得到與二期翻修一樣的手術效果。因此正確的病原體檢測不僅對于指導抗生素應用尤為重要，而且對于把握假體再植入時機也很關鍵。據(jù)文獻報道，二期翻修手術的成功率為73%～89%[20]。Dempsey等[21]報道全髖翻修術中取出的假體中有72%通過16s rRNA基因檢測法檢測到微生物，僅有22%通過傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測出微生物。因此不應低估假體周圍感染的發(fā)病率。

16S rRNA基因檢測跟傳統(tǒng)培養(yǎng)相比有更高的特異性和敏感性，具有檢測迅速、范圍廣泛、可以發(fā)現(xiàn)多重感染、不受近期抗生素應用的影響等優(yōu)點。同時該方法有容易污染、無法進行有效的藥敏試驗和價格昂貴等缺點，當臨床醫(yī)生遇到無法確定的試驗結果時應該和微生物實驗室的工作人員聯(lián)系，一起分析試驗結果，探討是否有必要重復試驗。收集標本前2周應該停用抗生素，否則會影響檢測陽性率。如果患者在近期用過抗生素，則強烈推薦超聲震蕩聯(lián)合16S rRNA基因檢測法提高病原體檢測率。

4 總結和展望

雖然16S rRNA基因檢測在PJI診斷中有很高的靈敏度和特異度，并且不受近期抗生素使用的影響，但是不應完全替代傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)，推薦將其作為傳統(tǒng)培養(yǎng)的補充，其適應證應僅限于臨床上懷疑感染而培養(yǎng)陰性的患者。16S rRNA基因檢測過程應該嚴格遵循實驗規(guī)范，不重復使用試劑和容器，盡最大可能避免污染的發(fā)生。因此推薦將超聲震蕩和16S rRNA基因檢測列入檢驗科常規(guī)檢驗項目，從而提高PJI診斷的準確性。

相信隨著微生物全基因組的完善、PCR和基因測序技術的改進、更廣譜的探針會問世，PJI病原體檢測也會越來越準確。病原體特異性PCR的應用可以大大縮短試驗時間，并且實現(xiàn)原地和實時發(fā)布監(jiān)測結果。另外，分子生物學檢測假體周圍感染的經(jīng)濟效益方面現(xiàn)如今還沒有相關研究，這也是一個可能會影響其未來應用前景的潛在因素。但隨著芯片技術的發(fā)展，PJI常見病原體特異性探針集成的基因芯片或者微流體芯片將會給PJI的快速診斷帶來前所未有的進步。