承德地區(qū)野生木蹄層孔菌的分離鑒定

崔馳浩 孫 寧 班立桐 黃 亮 史維麗 李春霞 王 玉 楊紅澎

承德地區(qū)野生木蹄層孔菌的分離鑒定

崔馳浩 孫 寧 班立桐*黃 亮 史維麗 李春霞 王 玉 楊紅澎

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

2016年10月6日在河北省承德市北大山石海森林公園內(nèi)樺樹樹干上采集到1株野生真菌，觀察該菌的子實(shí)體形態(tài)特征與菌絲體顯微結(jié)構(gòu)，對(duì)其 ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參照相關(guān)書籍記載的外觀形態(tài)，鑒定出該野生真菌隸屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），層孔菌屬（），為木蹄層孔菌（）。

木蹄層孔菌；形態(tài)鑒定；ITS鑒定

我國真菌資源豐富，有10萬余種，具有藥效的超過540種。這些真菌大多數(shù)為擔(dān)子菌亞門和子囊菌亞門[1]。木蹄層孔菌（），又名火域?qū)涌拙?，屬于?dān)子菌綱（Basidiomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），層孔菌屬（），是一種白腐菌[2]。木蹄層孔菌是生長于樺樹、楊樹、梨、蘋果等闊葉樹干上的一種大型真菌，常在環(huán)境陰濕或少光的環(huán)境下生長，其子實(shí)體為藥用部位[3]。

承德蘊(yùn)藏著豐富的具有較高營養(yǎng)保健及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的野生食用菌資源。目前，只有很少一部分野生真菌得到研究和開發(fā)，少數(shù)種類局限于簡(jiǎn)單的采摘和加工，而大多數(shù)種類未能得到有效的開發(fā)和利用[4]。本文從采集到的疑似野生木蹄層孔菌的形態(tài)鑒定入手，對(duì)其ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，并在基因組數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析其親緣關(guān)系，確定該菌株為木蹄層孔菌（）。菌絲體的獲得和準(zhǔn)確鑒定為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用承德野生木蹄層孔菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株。通過采集的新鮮野生子實(shí)體組織分離獲得斜面菌絲體，命名為TNCY001，目前該菌種保藏在天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心。

（2）PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L，pH自然。

（3）引物。采用文獻(xiàn)中通用引物：ITS1（5’-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3’），ITS4（5’-GGAAGTAAAAGTCG-TAACAAGG-3’）。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）子實(shí)體形態(tài)特征及菌絲體顯微結(jié)構(gòu)觀察。觀察子實(shí)體顏色、紋路及菌管顏色、形態(tài)、大小等典型外觀形態(tài)特征，測(cè)量子實(shí)體長度、寬度、厚度，拍照；并用刀片將分離純化的新鮮菌絲體置于載玻片上，乳酸石碳棉蘭染色1～2 min，置于100×油鏡下觀察拍照。

（2）菌絲體DNA提取及凝膠電泳檢測(cè)。25 ℃下靜置培養(yǎng)12 d后，收集菌絲體，使用天津蘭瑞生物公司提供的子實(shí)體高純度基因組DNA提取試劑盒，貨號(hào)為LRC141，進(jìn)行基因組DNA提取。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA置于－20 ℃保存?zhèn)溆?。? μL提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

（3）ITS-PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)。以基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1和ITS4 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其擴(kuò)增體系為：總體系為20 ul體系，其中10×PCR buffer 2uL，dNTP 1.6 uL ，ITS1 1.2 uL，ITS4 1.2 uL，Taq酶0.1 uL，模板1 uL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后在72 ℃延伸5 min，終止溫度4 ℃。擴(kuò)增得到片段，經(jīng)過瓊脂凝膠電泳后在凝膠電泳成像系統(tǒng)中觀察，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送生物工程（天津）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序得到的ITS序列在NCBI 進(jìn)行核酸序列BLAST比對(duì)，找出同源性最大的序列。

（4）系統(tǒng)發(fā)育分析。將TNCY001的ITS序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分別獲得與其具有較高同源性的同屬不同種的ITS序列；而后通過Clustal X對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)；最后采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定TNCY001的系統(tǒng)發(fā)育。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體的生態(tài)環(huán)境及其形態(tài)

本試驗(yàn)材料野生真菌為2016年10月6日采集自河北省承德市北大山石海森林公園內(nèi)樺樹樹干上，其子實(shí)體形態(tài)特征如圖1。子實(shí)體大小6×5（cm），厚4 cm，馬蹄形，無柄，色呈棕褐，有厚角質(zhì)皮殼及環(huán)狀棱紋，菌肉部位觸感較軟，邊緣鈍，菌管銹褐色，厚0.5 cm，軟木酸質(zhì)。初步鑒定為層孔菌屬（）物種。

圖1 TNCY001的子實(shí)體形態(tài)

TNCY001菌絲生長濃密，氣生菌絲較多，呈放射狀向外擴(kuò)張，菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，鋪滿平板需要10 d，菌種培養(yǎng)時(shí)間長于15 d，平皿反面會(huì)出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象（圖2）。

圖2 TNCY001平板菌落形態(tài)

2.2 菌絲體的顯微結(jié)構(gòu)

將分離純化的菌絲體進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，TNCY001 菌絲體為雙核細(xì)胞，菌絲間橫隔短，易明顯觀察到液泡和細(xì)胞核，具有鎖狀聯(lián)合，可進(jìn)行人工馴化栽培（圖3）。

圖3 TNCY001二級(jí)菌絲

2.3 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測(cè)

對(duì)菌絲體進(jìn)行DNA提取，電泳條帶清晰、較明亮，無明顯后拖尾現(xiàn)象（圖4）。說明基因組DNA完整，可以作為PCR反應(yīng)的模板。

2.4 ITS-PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)

以提取的DNA為模板，ITS1、ITS4 為引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后出現(xiàn)清晰明亮的單一帶（圖5），顯示片段大小為500～700 bp。

圖4 TNCY001 DNA 電泳結(jié)果

圖5 ITS-PCR電泳結(jié)果

2.5 TNCY001的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送樣進(jìn)行測(cè)序，得到的序列長度為624 bp，序列號(hào)在NCBI上注冊(cè)為MK910113。

分支處的數(shù)字為不同菌株間的相似值，菌株名稱后面的字母及數(shù)字為各菌株在Genbank中的登錄號(hào)，序列差異在1%水平測(cè)定。

將序列放入NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同一科已經(jīng)鑒定出來的ITS片段進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建。從圖6可以看出，TNCY001與 HM584810.1基因片段相似度高達(dá)99%，遺傳距離很近。

3 結(jié)論與討論

綜合子實(shí)體特征和ITS序列的比對(duì)結(jié)果，參照卯曉嵐主編的《中國大型真菌》第473頁記載的外觀形態(tài)，子實(shí)體大至巨大，馬蹄形，多呈灰、灰褐、淺褐色至黑色，有一層厚的角質(zhì)皮殼及明顯環(huán)帶和環(huán)棱，無柄，邊緣鈍。從而可鑒定出該野生真菌為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、層孔菌屬（）的木蹄層孔菌（）。

圖6 基于ITS-PCR序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析

傳統(tǒng)分類法主要基于形態(tài)學(xué)特征，其優(yōu)勢(shì)是易于觀察與比較，需要專業(yè)的人士才能正確分類。目前，由于外界環(huán)境條件、基因變異、地域分割等原因造成種內(nèi)形態(tài)多樣性的現(xiàn)象，使得分類學(xué)家對(duì)親緣種的鑒定存在一定的困難。因此，當(dāng)遇到傳統(tǒng)分類方法不能有效區(qū)分疑難種時(shí)，采用分子生物學(xué)技術(shù)作為補(bǔ)充顯得很有必要。

真菌核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）受外界環(huán)境影響較小，進(jìn)化速度快，表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)保守、種間差異較為明顯[5]。rDNA ITS 序列作為一種遺傳分子標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于松茸[6]、羊肚菌[7]、靈芝[8]等食藥用菌的菌種鑒定。因此，該研究從分子水平上，基于ITS序列對(duì)TNCD001進(jìn)行物種鑒定。依據(jù)序列相似性＜95％可鑒別為相同科；95％～99％可鑒別為相同屬；＞99％可鑒別為相同種[9]，TNCY001鑒定為。此株承德野生真菌遺傳分類地位的解析，對(duì)TNCY001的人工馴化栽培和生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 戴玉成, 周麗偉, 楊祝良, 等. 中國食用菌名錄[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2010, 2(1): 1-3.

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Isolation and identification ofwildfomentarius from Chengde city

Cui Chihao Sun Ning Ban Litong*Huang Liang Shi Weili Li Chunxia Wang Yu Yang Hongpeng

（Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384, China）

Wild edible mushrooms were collected on the trunk of birch trees in Shihai Forest Park, Beidashan, Chengde city, Hebei province on Oct. 6, 2016. The morphological characteristics and mycelium growth of wild edible mushrooms bodies were observed. The ITS sequences were amplified, sequenced, and the developmental trees were constructed. According to the appearance offomentarius recorded in the relevant literatures, the wild edible mushrooms was identified as basidiomycetes, Polyporales, Polyporaceae, Fomes, as, The results of this study provide a foundation for the further development of the application value.

; morphological identification; ITS identification

S567.3

B

2095-0934（2019）05-336-04

天津市蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2017015）；天津市特支計(jì)劃項(xiàng)目（TJTZJH-QNBJRC-2-12）

崔馳浩（1995—），男，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑锔髋c栽培學(xué)。Tel：（022）23781298；E-mail：842953269@qq.com。

班立桐，E-mail：banlitong@126.com。