神經(jīng)肌肉接頭在增齡相關(guān)老年肌少癥中的作用探討

老年肌少癥(sarcopenia)是近十年才逐漸被廣為人知的一個(gè)概念,增齡是導(dǎo)致老年肌少癥最重要的原因。肌少癥發(fā)病機(jī)制眾多,線粒體數(shù)量和功能異常、慢性炎癥、肌細(xì)胞凋亡、肌肉衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少、激素水平紊亂、營養(yǎng)不足、運(yùn)動(dòng)減少等因素都可以促進(jìn)肌少癥的發(fā)生發(fā)展。作為連接運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突末梢和肌纖維的效應(yīng)位點(diǎn),神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction, NMJ)在老年肌少癥發(fā)病過程中具有非常獨(dú)特且極其重要的作用[1-2]。作為“興奮-收縮偶聯(lián)”載體，把神經(jīng)沖動(dòng)轉(zhuǎn)化為機(jī)械收縮的NMJ到底在老年肌少癥過程中發(fā)揮了什么樣的作用,本文將對(duì)此進(jìn)行綜述。

1 NMJ的組成

完整的NMJ由多種細(xì)胞類型組成:運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、骨骼肌纖維、神經(jīng)元末梢部位的Schwann細(xì)胞和Kranocyte細(xì)胞[3]。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和骨骼肌纖維是主要組成細(xì)胞,末梢Schwann細(xì)胞和Kranocyte細(xì)胞共表達(dá)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢及其所對(duì)應(yīng)的肌纖維,它們表達(dá)營養(yǎng)因子、黏附因子和生長相關(guān)因子,為NMJ發(fā)育和再生過程提供營養(yǎng)支持,并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

從結(jié)構(gòu)上來看,脊椎動(dòng)物的NMJ包括3個(gè)部分[4]:(1) 突觸前膜:即軸突末端,負(fù)責(zé)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)的合成、儲(chǔ)存和釋放。ACh由突觸囊泡(synaptic vesicles)所包裹,許多容易釋放的囊泡傾向于錨定在突觸前膜活性區(qū)域(active zones)。(2) 突觸后膜:也稱為運(yùn)動(dòng)終板(end plate),是與軸突末端對(duì)應(yīng)的肌纖維部位。運(yùn)動(dòng)終板有規(guī)律的內(nèi)凹,形成許多皺褶,皺褶的存在使終板膜面積擴(kuò)大了4～5倍,皺褶的嵴部與突觸前膜的活性區(qū)域相對(duì)應(yīng),內(nèi)含有高濃度的乙酰膽堿受體(AChR)、肌肉特異型激酶等因子;皺褶底部含有電壓門控鈉離子通道。(3) 突觸間隙:突觸前膜和突觸后膜之間寬約50 nm的空間,內(nèi)部存在乙酰膽堿酯酶(AChE)等大分子復(fù)合物,保證神經(jīng)遞質(zhì)快速釋放和降解。

NMJ僅占肌纖維表面積的0.1%左右,但卻能將神經(jīng)沖動(dòng)從運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元傳遞到肌纖維，形成動(dòng)作電位并產(chǎn)生肌纖維的機(jī)械收縮,實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨骼肌的支配[6]。NMJ傳遞興奮的過程主要包括3個(gè)方面[5]:(1)突觸前膜存在大量的活性區(qū)域,使得神經(jīng)遞質(zhì)可以快速釋放;(2)AChR在突觸后膜褶皺頂部聚集,并與活性區(qū)域?qū)?yīng),提高了AChR活化效率和突觸電位生成效率;(3)AChE快速清除ACh,使得傳輸具有時(shí)間保真度。

2 NMJ的發(fā)育和成熟

在發(fā)育過程中,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞經(jīng)過長途遷移、相遇并形成功能性突觸[6]。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突到達(dá)肌纖維之前,原始的AChR團(tuán)簇在肌管的中心,稱為預(yù)成形。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突到達(dá)部分預(yù)成形的AChR簇,隨后受神經(jīng)支配的AChR簇不斷擴(kuò)大,而未支配的預(yù)成形位點(diǎn)最終消散,最后神經(jīng)末梢與肌纖維形成1∶1的聯(lián)系。

出生之前,NMJ在形態(tài)和功能上都是不成熟的。出生以后,突觸后膜內(nèi)陷形成許多褶皺,NMJ從扁平的斑塊狀變成典型的“pretzel”狀[7]。AChR屬于煙堿樣受體,由5個(gè)蛋白亞基構(gòu)成,排列成玫瑰狀的管形結(jié)構(gòu)。成熟之前,AChR的亞基構(gòu)成是α2βδγ,成熟之后γ亞基被ε替代,形成α2βδε結(jié)構(gòu)。同時(shí),突觸部位的AChR密度增加10倍,從大約1000 個(gè)/μm2到超過10 000 個(gè)/μm2,而突觸外的AChR密度明顯下降,小于10 個(gè)/μm2。

NMJ的發(fā)育和成熟依賴于神經(jīng)來源和肌纖維來源的眾多分子之間的協(xié)同作用,并伴有終末Schwann細(xì)胞的參與,最終結(jié)果是形成一個(gè)高效的遞質(zhì)傳遞結(jié)構(gòu),肌纖維由單一的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突支配,突觸后膜遞質(zhì)受體與突觸前膜活性區(qū)域完全一致[3]。或者說,NMJ乃至整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)突觸的發(fā)育過程就是突觸前后膜特化性改變的過程,通過神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)軸突末端和肌纖維之間進(jìn)行“電-化學(xué)-電”的信號(hào)傳導(dǎo),引起肌肉收縮。

3 老年肌少癥發(fā)生發(fā)展過程中NMJ的改變

增齡是導(dǎo)致老年肌少癥最主要的原因,增齡過程中NMJ是否會(huì)發(fā)生改變，以及這些改變對(duì)突觸功能有什么影響,至今仍然存在爭(zhēng)議[8]。然而,AChE染色、光鏡和電鏡顯示,衰老的NMJ形態(tài)有顯著變化。AChE染色發(fā)現(xiàn)NMJ呈現(xiàn)“碎片化”改變,突觸后膜區(qū)域變大但呈現(xiàn)破碎狀態(tài),突觸皺褶變性、AChR分散分布，與突觸前膜活性區(qū)域錯(cuò)位。神經(jīng)末梢也變得更加曲張,軸突終端異常變薄、膨脹、發(fā)芽,其內(nèi)部的突觸囊泡數(shù)量減少。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有大片的肌纖維膜,其中有明顯的連接褶皺,但沒有被神經(jīng)末梢占據(jù),或神經(jīng)末梢被Schwann細(xì)胞包裹,部分Schwann細(xì)胞直接進(jìn)入突觸間隙[9-10]。

衰老后NMJ碎片化改變的可能原因是肌纖維中細(xì)胞核位置的中央化改變。肌纖維是多核細(xì)胞,成熟纖維的細(xì)胞核通常位于肌膜下方。在老化的肌肉中,許多纖維的細(xì)胞核不是位于纖維的邊緣,而是在纖維的中心區(qū)域[11]。

損傷肌肉纖維也會(huì)在NMJ中產(chǎn)生類似于衰老的表型變化[12],當(dāng)肌纖維退化時(shí),可以觀察到大部分AChR丟失,神經(jīng)末梢與肌纖維脫離。然后附近的神經(jīng)迅速恢復(fù)對(duì)肌纖維的支配,在之前受損的纖維上出現(xiàn)了一組新的AChR碎片,并可見中央核。

總體而言,NMJ的衰老是一個(gè)神經(jīng)末梢從突觸接觸中不斷退出的過程,導(dǎo)致肌纖維局灶性去神經(jīng)支配,隨后神經(jīng)再生/發(fā)芽，重新支配肌纖維。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:NMJ在生命過程中的變化,是一種嘗試通過向失去運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配的肌纖維提供新的神經(jīng)支配、從而補(bǔ)償衰老過程中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐漸喪失的過程[8]。

然而,非常關(guān)鍵、但目前尚不完全清楚的是,這些變化是否反映了NMJ結(jié)構(gòu)和功能障礙是導(dǎo)致老年肌少癥的主要原因,還是NMJ受損是繼發(fā)于與老年肌少癥有關(guān)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和(或)肌纖維功能障礙[3,8]。

4 影響NMJ形成的因子

4.1 對(duì)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)發(fā)揮重要作用的因子

4.1.1 AChR及其亞單位:AChR從“胎兒”向“成人”轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)是γ亞單位被ε替代,形成α2βδε五聚體結(jié)構(gòu)[13]。AChR聚集于突觸后膜褶皺頂部,是NMJ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能成熟的重要標(biāo)志。如果AChR從終板膜大量丟失,將會(huì)導(dǎo)致NMJ的碎片化改變。皺褶頂部AChR的密度由AChR在突觸后膜的插入和移除速率決定,這種插入和移除受到眾多其他因子的干預(yù)[5]。

4.1.2 ACh:ACh是脊椎動(dòng)物NMJ的神經(jīng)遞質(zhì)。ACh最主要的作用就是將運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)到突觸后膜,引起肌纖維的機(jī)械收縮。ACh包含于突觸囊泡內(nèi),一般錨定在突觸前膜的活性區(qū)域,在神經(jīng)末梢動(dòng)作電位作用下,突觸囊泡與突觸前膜活性區(qū)域融合,ACh通過胞吞作用快速釋放到突觸間隙,與突觸后膜上的AChR結(jié)合引起肌纖維的機(jī)械收縮。完成使命的ACh被AChE快速分解,或者擴(kuò)散到突觸間隙外。

4.1.3 AChE:AChE主要富集在突觸間隙,負(fù)責(zé)水解從運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢釋放出來的ACh,從而終止其對(duì)突觸后膜的興奮作用,這是一個(gè)非常迅速的過程,可以防止單個(gè)AChR通道對(duì)神經(jīng)纖維單個(gè)動(dòng)作電位的重復(fù)激活。如果AChE缺乏或者活性受損,會(huì)導(dǎo)致AChR的持續(xù)激活、AChR通道中鈣離子過度流入,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白酶如calpain的激活,從而破壞突觸后膜。

4.1.4 電壓門控鈉離子通道(Nav1.5 和 Nav1.4):電壓門控鈉通道是第二類離子通道,定位于突觸褶皺凹槽中。它們降低了將終板電位產(chǎn)生的去極化轉(zhuǎn)化為肌纖維中動(dòng)作電位的閾值,因此有助于神經(jīng)肌肉興奮傳導(dǎo)。

4.2 對(duì)NMJ形成發(fā)揮重要作用的蛋白因子

4.2.1 Argin:雖然Argin在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、肌肉和Schwann細(xì)胞都有表達(dá),但只有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)的亞型具有高度的AChR聚集作用。1990年McMahan提出了“Argin假說”[14]:Agrin與肌膜中的受體相互作用,促進(jìn)AChR的聚集和穩(wěn)定,從而在NMJ發(fā)育過程中觸發(fā)突觸后結(jié)構(gòu)的形成。Agrin基因缺陷小鼠,盡管肌纖維分化不受影響,但神經(jīng)末梢不能錨定在肌纖維表面,突觸后膜無AChR聚集,無法建立起功能性的突觸連接,加入外源性的Agrin后仍然可以誘導(dǎo)突觸后膜AChR聚集。

Agrin可以將多種蛋白,包括肌肉特異性激酶(muscle specific kinase, MuSK)、AChR、人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Nrg-1)、突觸后膜受體締合蛋白(Rapsyn)、AChE聚集于突觸后膜,誘發(fā)下游突觸特異性基因表達(dá),并促進(jìn)信號(hào)分子逆行輸送,進(jìn)一步促進(jìn)突觸前膜分化。

但是在Argin基因缺陷小鼠早期胎兒膈肌中,可以觀察到少量AChR聚集,部分與神經(jīng)纖維建立了聯(lián)系[15]。這一現(xiàn)象提示Argin對(duì)AChR的調(diào)控在突觸發(fā)育早期不明顯,說明Argin未必是誘導(dǎo)突觸后膜分化的唯一信號(hào)分子。

4.2.2 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(low-density lipoprotein receptor-related protein 4, Lrp4):Lrp4的主要作用是與MuSK結(jié)合形成受體復(fù)合物，然后共同結(jié)合Agrin蛋白,并通過Agrin介導(dǎo)MuSK酪氨酸磷酸化。Lrp4只與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分泌的Agrin結(jié)合,Agrin又可以促進(jìn)Lrp4與MuSK的結(jié)合[16-17]。體外培養(yǎng)Lrp4缺陷的小鼠肌管,即使添加Agrin也不能形成AChR聚集簇,說明Lrp4是Agrin/Lrp4/MuSK復(fù)合物中不可或缺的一環(huán)。

在NMJ中,Lrp4同時(shí)表達(dá)于骨骼肌纖維和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在骨骼肌和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中選擇性缺失Lrp4,可以觀察到NMJ的形成完全消失，但如果僅在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或者骨骼肌中選擇性缺失Lrp4不會(huì)導(dǎo)致任何缺陷表型[18]。

4.2.3 MuSK:MuSK是Lrp4-MuSK受體復(fù)合物中的重要信號(hào)元件,與Agrin結(jié)合后觸發(fā)了突觸后結(jié)構(gòu)的分化,MuSK對(duì)胚胎肌管AChR的聚集、成熟突觸后膜AChR的錨定和聚集都發(fā)揮了重要作用。MuSK缺陷小鼠培養(yǎng)的肌管不會(huì)積累任何自發(fā)的AChR聚集簇,也不會(huì)對(duì)外源性的Agrin產(chǎn)生反應(yīng)。

MuSK在早期肌小體就開始表達(dá),貫穿于整個(gè)肌肉發(fā)育過程[19]。激活的MuSK除了促進(jìn)肌管AChR的聚集,當(dāng)它在受神經(jīng)支配的骨骼肌非突觸區(qū)表達(dá)時(shí),可導(dǎo)致無神經(jīng)突觸后結(jié)構(gòu)的形成。此外,MuSK在一定程度上可以誘導(dǎo)作用于突觸前運(yùn)動(dòng)軸突的逆行分化信號(hào)[19]。

4.2.4 Downstream of tyrosine kinases-7 (Dok-7):與Lrp4是MuSK的共同受體類似,Dok-7是MuSK活化所必需的適配體,或者說是MuSK的接頭分子[20]。但與Lrp4不同的是,Dok-7僅表達(dá)于骨骼肌和心肌。Dok-7基因敲除小鼠中培養(yǎng)的肌管在添加Agrin后不會(huì)形成AChR簇,MuSK也不會(huì)被激活,這表明Dok-7對(duì)MuSK的功能是必需的。Dok-7一個(gè)不尋常的方面是,過表達(dá)Dok-7足以在培養(yǎng)的肌管中形成AChR聚集簇,并使小鼠在沒有MuSK的情況下存活數(shù)周[20-21]。

4.2.5 Rapsyn:Rapsyn是一種細(xì)胞質(zhì)支架蛋白,在NMJ早期發(fā)育階段就已經(jīng)存在,在成年肌纖維中,主要表達(dá)于突觸部位。在MuSK作用下,Rapsyn與AChR緊密結(jié)合,形成兩種蛋白復(fù)合物的高密度網(wǎng)絡(luò)[22]。Rapsyn對(duì)AChR與突觸后結(jié)構(gòu)的連接起著至關(guān)重要的作用,但對(duì)突觸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄沒有明顯作用。因此，Rapsn基因敲除小鼠的表型沒有MuSK、Lrp4或Dok-7缺陷小鼠那么嚴(yán)重,出生后它們能夠微弱地呼吸,存活數(shù)個(gè)小時(shí)。

4.3 對(duì)NMJ形成發(fā)揮輔助作用的蛋白因子

4.3.1 Wnts:Wnts是一大類分泌型糖蛋白,存在多種亞型,它的最大意義在于提供了一種非Agrin依賴的信號(hào)通路，介導(dǎo)早期NMJ的特化過程。Wnt蛋白通過其信號(hào)通路中的關(guān)鍵腳手架分子Dvl因子與MuSK的胞內(nèi)域結(jié)合,從而激活MuSK,并促進(jìn)AChR在肌肉中心區(qū)域的預(yù)排[23]。Wnt-3、Wnt-4、Wnt-9a和Wnt-11都具有這種作用,而另外一些Wnts則抑制Agrin介導(dǎo)的AChR 聚集簇形成。

Wnts在NMJ形成過程中發(fā)揮了重要作用,部分作用是通過MuSK實(shí)現(xiàn)的。但是,所涉及的具體機(jī)制仍然不清楚,這與存在過多Wnt亞型、相互之間形成干擾有關(guān)。

4.3.2 其他因子:肌營養(yǎng)不良蛋白-糖蛋白復(fù)合物(dystrophin-glycoprotein complex, DGC)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulins, Nrg)及其酪氨酸激酶(ErbB)受體都在突觸后膜特化過程中發(fā)揮相應(yīng)的作用,它們的缺失會(huì)影響AChR穩(wěn)定性、AChR密度和褶皺形成。

另外,某些營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF);胰島素樣生長因子(IGF-1)及一系列細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如層連蛋白laminin、膠原蛋白collagen Ⅳ和ⅩⅢ;部分miRNA如miR-206、miR-218都可能參與了老年肌少癥過程中NMJ的退變。

突觸后膜上AChR的半衰期約為13 d,蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)在AChR的循環(huán)利用中發(fā)揮了多方面的作用。我們?cè)诩韧芯恐幸舶l(fā)現(xiàn),在老年Ⅱ型肌纖維NMJ部位,PKA RIIa異常聚集,并且和cTnT相結(jié)合,直接介導(dǎo)了cTnT促進(jìn)Ⅱ型肌纖維NMJ增齡過程中的退變[24]。

5 影響NMJ老化退變的信號(hào)機(jī)制

5.1 Agrin-LRP4-MuSK信號(hào)通路 這是調(diào)節(jié)突觸后膜AChR定位并聚集成簇的經(jīng)典通路,也是老年肌少癥NMJ受損最被關(guān)注的通路。如前所述,Agrin與LRP4、MuSK結(jié)合形成復(fù)合物,并激活MuSK,活化的MuSK招募AChR偶聯(lián)蛋白R(shí)apsyn,促進(jìn)AChR在突觸后膜定位和聚集,從而調(diào)節(jié)NMJ的形成。衰老可以引起Agrin的異常剪切[25],異常的Agrin無法激活MuSK,從而擾亂了AChR的定位和聚集,導(dǎo)致NMJ退變。LRP4和MuSK基因在衰老過程中出現(xiàn)異常表達(dá)[26],這也導(dǎo)致NMJ形成障礙。

Agrin-LRP4-MuSK信號(hào)通路基本上可以解釋NMJ突觸前、突觸后裝置的精確匹配。但這條通路也不是調(diào)控AChR聚集的唯一信號(hào)通路,另外NMJ的發(fā)育和維持穩(wěn)定并不是從神經(jīng)到肌肉的單向調(diào)控,還存在從肌肉到神經(jīng)的逆向信號(hào)傳導(dǎo)。比如,Lrp4會(huì)逆行地從肌肉向神經(jīng)傳遞信號(hào),以保持神經(jīng)-肌肉的完整連接[27]。

5.2 Wnt信號(hào)通路 已有研究表明,LRP4和MuSK突變小鼠的NMJ發(fā)育缺陷表型要比Agrin突變小鼠嚴(yán)重得多,尤其在胚胎發(fā)育早期,LRP4和MuSK突變小鼠骨骼肌表面AChR 聚集簇“預(yù)排”完全消失,而Agrin突變小鼠依舊能夠形成AChR聚集簇“預(yù)排”,提示體內(nèi)存在一種非Agrin依賴的信號(hào)通路介導(dǎo)早期NMJ的發(fā)育。Wnt信號(hào)通路就發(fā)揮這樣的作用。

Agrin缺乏時(shí),MuSK通過與Wnt蛋白結(jié)合而被激活,在通路關(guān)鍵腳手架分子Dvl和下游信號(hào)分子β-Catenin作用下,發(fā)揮調(diào)節(jié)AChR聚集的作用。衰老過程中，Wnt信號(hào)通路表達(dá)下調(diào),降低了非Agrin依賴途徑MuSK的激活可能性,干擾了AChR聚集簇“預(yù)排”的形成。但不同類型Wnt分子可能在NMJ發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Wnt3a、7a、8a和10b能夠抑制Agrin介導(dǎo)的AChR聚集簇形成,而Wnt9a、9b、10和16則以Agrin非依賴方式誘導(dǎo)AChR聚集簇形成[23]。

5.3 線粒體功能障礙和PGC-1α信號(hào)通路 線粒體功能障礙是老年肌少癥發(fā)病過程中的重要方面[28],增齡相關(guān)的PGC-1α信號(hào)通路下調(diào)會(huì)導(dǎo)致NMJ不穩(wěn)定、肌纖維神經(jīng)支配改變[29]。

5.4 其他可能的信號(hào)通路和機(jī)制 NMJ重構(gòu)過程中受到自噬的影響,盡管迄今尚未發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因與老年肌少癥直接相關(guān),但自噬的良好平衡對(duì)于保持骨骼肌的完整是至關(guān)重要的。第二信使在營養(yǎng)不良肌肉中對(duì)保持NMJ連續(xù)性具有關(guān)鍵作用[30],但是否和老年肌少癥NMJ的改變有關(guān)尚不明確。

6 小結(jié)

NMJ是神經(jīng)肌肉系統(tǒng)中信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是老年肌少癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵方面。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了眾多和突觸前膜、突觸后膜生長發(fā)育相關(guān)的因子,也發(fā)現(xiàn)了一些有意義的信號(hào)通路,它們都對(duì)NMJ的形成和穩(wěn)定發(fā)揮各自的作用,為老年肌少癥的臨床干預(yù)提供了可能的靶點(diǎn)。隨著連續(xù)活體成像結(jié)合特殊染色、示蹤標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因編輯等技術(shù)的發(fā)展,我們將更加清晰地了解老年肌少癥發(fā)生過程中NMJ的形態(tài)學(xué)變化和功能改變,更加深入的明確這種退化內(nèi)在的分子機(jī)制,從而為老年肌少癥的診治提供新的理論依據(jù)和有效干預(yù)途徑。