垂枝紅千層內(nèi)生真菌的分離鑒定及其生物活性

李賽妮 陳玉嬋 劉洪新 朱牧孜 章衛(wèi)民

【摘?要】?目的：研究垂枝紅千層內(nèi)生真菌的分離鑒定及其生物活性，為進(jìn)一步發(fā)掘活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。方法：通過組織分離法分離培養(yǎng)垂枝紅千層內(nèi)生真菌，通過ITS序列分析對分離的真菌進(jìn)行鑒定，并采用濾紙片法和SRB法對內(nèi)生真菌的發(fā)酵液提取物進(jìn)行抗菌和細(xì)胞毒活性研究。結(jié)果：共分離得到29個(gè)菌株，鑒定為17屬20種，其中以黑孢霉屬（Nigrospora）、間座殼屬（Diaporthe）和刺盤孢屬（Colletotrichum）為優(yōu)勢類群;菌株A797、A798和A809的發(fā)酵提取物，對金色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有較好抑制活性（抑菌圈直徑≥13?mm）;當(dāng)發(fā)酵液提取物的作用濃度為100?μg/mL時(shí)，菌株A781、A785和A805對4株受試腫瘤細(xì)胞均具有較明顯的抑制作用（抑制率≥90%以上）。結(jié)論：垂枝紅千層內(nèi)生真菌多樣性豐富，部分菌株具有較好的抗菌和細(xì)胞毒活性，值得進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】?紅千層;內(nèi)生真菌;分離鑒定;抗菌活性;細(xì)胞毒活性

【中圖分類號】R285.5?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0016-06

Isolation，?Identification?andBiological?Activities?of?Endophytic?Fungi?from?Callistemon?viminalis

LI?Saini?CHEN?Yuchan?LIU?Hongxin?ZHU?Muzi?ZHANG?Weimin*

State?Key?Laboratory?of?Applied?Microbiology?Southern?China/Guangdong?Provincial?Key?Laboratory?of?Microbial?Culture?Collection?and?Application/?Guangdong?Open?Laboratory?of?Applied?Microbiology/?Guangdong?Institute?of?Microbiology，Guangzhou?510070，?China

Abstract：Objective?To?isolate?and?identify?endophytic?fungi?from?Callistemon?viminalis?and?investigate?their?biological?activities，?thus?providing?a?theoretical?basis?for?further?searchfor?biologically?activemetabolites.Method?Endophyticfungiwereisolated?and?purified?from?C.?viminalis?by?tissue?isolation?method?and?identified?by?analysis?of?ITS?sequences.?Antibacterial?and?cytotoxic?activities?of?fermentation?broth?extracts?of?these?endophytic?fungi?were?examined?by?the?filter?paper?dispersion?method?andthe?Sulforhodamine?B（SRB），?respectively.?Results?29?strains?were?isolated?and?identified?as?20?species?in?17?genera，?among?which?Nigrospora，?Diaporthe?and?Colletotrichum?were?the?dominant?genera.?The?fermentation?extracts?of?strains?A797，?A798?and?A809?showed?inhibitory?activity?against?Staphylococcus?aureusand?Escherichia?coliwithinhibitionzone?diameters?of?over?13?mm.?The?strains?A781，?A785?and?A805?exhibited?cytotoxic?activity?against?the?tested?tumor?cell?lines?with?inhibitory?rates?of?over?90%when?the?concentration?of?their?fermentation?extracts?was?100?μg/mL.?Conclusion?Endophytic?fungi?from?C.?viminalisare?rich?in?diversity?and?several?strains?showed?antibacterial?and?cytotoxic?activities，?which?deserved?further?study.

Keywords：Callistemon?viminalis;?Endophytic?fungi;?Isolation?and?Identification;?Antibacterial?Activity;?Cytotoxicity

植物內(nèi)生真菌（Endophytic?fungi）是一類重要的微生物資源，其生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，在演化過程中與宿主植物形成了互惠共生關(guān)系，能產(chǎn)生與宿主相同或相近的代謝產(chǎn)物，甚至能產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及病蟲害的防治等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1]。

垂枝紅千層（Callistemon?viminalis）為桃金娘科（Myrtaceae）紅千層屬（Callistemon）植物，原產(chǎn)于澳大利亞，國內(nèi)多個(gè)地區(qū)都有栽種，廣泛用于綠化、園藝觀賞、入藥和制取精油等[2]。紅千層屬植物的化學(xué)成分和生物活性研究表明，其枝葉含有間苯三酚類及黃酮類等化合物[3-5]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[6-8]。迄今垂枝紅千層內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物研究未見報(bào)道。為了充分發(fā)掘該植物的內(nèi)生真菌資源，本研究對采自華南植物園的垂枝紅千層進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和鑒定，探討垂枝紅千層內(nèi)生真菌的多樣性，并對分離到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提物進(jìn)行抗菌和細(xì)胞毒活性研究，旨在篩選出具有生物活性的菌株，為進(jìn)一步研究其活性代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1?材料與儀器

1.1?材料

1.1.1?植物材料、供試菌株及細(xì)胞株?垂枝紅千層健康植株于2016年01月采自廣州華南植物園。

供試指示菌細(xì)菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus，SA）?、大腸桿菌（Escherichia?coli，EC）、枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis，BS）。

供試腫瘤細(xì)胞株為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（SF-268）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H460）、肝癌細(xì)胞（HepG-2）。以上所有菌株和細(xì)胞株均保藏于廣東省微生物研究所。

1.1.2?培養(yǎng)基分離?培養(yǎng)基為PDA雙抗培養(yǎng)基：馬鈴薯?200g，葡萄糖?20g，KH2PO4?3g，KH2PO4?3g，MgSO4·7H2O?1.5?g，維生素B1?10?mg，瓊脂18?g，蒸餾水1?L;滅菌后分別加入100?μg/mL硫酸卡那霉素和氨芐青霉素。

PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，?KH2PO43g，MgSO4·7H2O?0.15g，維生素B110mg，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃下滅菌30min。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和1%雙抗（10000?U/mL青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混合均勻，4℃冰箱保存。

1.1.3?試劑RPMI-1640?培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（10000?U/mL青霉素+鏈霉素）均購自Gibco公司;磺酰羅丹明B（SRB）、二甲基亞砜（DMSO）、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、順鉑（cisplatin）均購自Sigma公司;乙醇、乙酸乙酯、甲醇等其他分析純化學(xué)試劑購于廣州化學(xué)試劑廠，用于基因擴(kuò)增的Taq酶及其他的PCR相關(guān)試劑購于廣州美基生物科技有限公司。

1.1.4?主要儀器YXQ-WY21-600?電熱高壓蒸汽滅菌鍋，廣州市華南醫(yī)療器械有限公司;Mastercycler?gradient?5331?PCR儀，Eppendorf公司;MGC-250BP-2?培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;164-5050?Powerpac?Basic?Power?Supply基礎(chǔ)型電泳儀，Bio-Rad公司;DMI3000B倒置顯微鏡，Leica公司;S-3000N掃描電鏡，日立公司;Multiskan酶標(biāo)儀，Thermo公司;2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱，Shellab公司;RE-2000?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;THZ-C-1搖床，廣州市正一科技有限公司。

2?方法

2.1?內(nèi)生真菌的分離純化?將采集的新鮮樣品用清水沖洗，然后用無菌水漂洗2次，放入75%的乙醇中浸泡1min，取出后用無菌水漂洗3次，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡1min，取出后用無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干水分。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5cm?×?0.5cm的方塊;枝條用無菌手術(shù)剪去兩端，取中間部位剪成1cm長的小段;用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對照。處理好的樣品放入事先準(zhǔn)備好的PDA雙抗平板培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種4塊相同類型組織塊，26℃恒溫培養(yǎng)5～7d，待培養(yǎng)基上可觀察到從組織塊內(nèi)部向周圍長出菌絲時(shí)，挑取形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)直至純化后，將菌株轉(zhuǎn)接到裝有PDA培養(yǎng)基的斜面上，置于4oC冰箱保存，備用。

2.2?內(nèi)生真菌的鑒定?采用真菌基因組DNA提取試劑盒（Magen）提取內(nèi)生真菌的基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板[9]。PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA?ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）[10]擴(kuò)增分離菌株的rDNA?ITS區(qū)。PCR采用40?μL反應(yīng)體系，通過Ex??Taq（TaKaRa）進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán);最后72oC延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠跑膠驗(yàn)證，將有目的條帶的反應(yīng)產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索分析，對分離菌株進(jìn)行鑒定。

2.3?菌株粗提物浸膏的制備?將4?℃低溫保藏的菌株分別接種到PDA平板上，27?℃活化?3?d，挑取各菌株接種到PD液體培養(yǎng)基中，28?℃、120?r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)?7?d，用四層紗布過濾收集發(fā)酵液。用乙酸乙酯等體積萃取發(fā)酵液4次，合并萃取液于45℃減壓濃縮，得到各菌株粗提物浸膏。取以上各菌株發(fā)酵液粗提物適量，稱重，備用。

2.4?抗細(xì)菌活性測定?將各供試細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水稀釋，配制成?1×105～1×107CFU/mL的菌液。吸取?1mL菌液于滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入已冷卻到合適溫度的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻，待冷卻之后放置己滅菌的直徑為?6mm濾紙片，分別吸取提取液?5μL滴加于濾紙片上，以DMSO代替樣品提取液作空白對照，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以氨芐青霉素作陽性對照，大腸桿菌以硫酸卡那霉素作陽性對照。置37℃恒溫箱培養(yǎng)16～24h，觀察細(xì)菌生長情況并測量抑菌圈大小。

2.5?細(xì)胞毒活性測定?采用SRB法[11]測定發(fā)酵提取物的細(xì)胞毒活性。取對數(shù)生長期的NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2細(xì)胞，用胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力大于95%后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104?個(gè)/mL，細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)空白孔調(diào)零，于37?℃、5%?CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20μL待測樣品，陰性對照加20μL培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，加入50μL?50%冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4℃放置1h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1%冰醋酸配制的SRB溶液（4mg/mL）100μL/孔，室溫中染色30min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后每孔加入200μL濃度為10mmol/mL的Tris溶液，用酶標(biāo)儀測定570nm處的吸光度（A）值，按以下公式計(jì)算提取物對細(xì)胞生長的抑制率：

細(xì)胞生長抑制率（%）?=?（1-A樣品組/A對照組）?×100%

3?結(jié)果

3.1?內(nèi)生真菌的分離與鑒定?從垂枝紅千層的莖、葉中分離到29株內(nèi)生真菌，將測序后獲得的ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析并獲得登錄號，結(jié)果見表1。從表1可以看出，分離菌株鑒定為17屬20種，未鑒定至種名的有4?株;其中以黑孢霉屬（Nigrospora）、間座殼屬（Diaporthe）和刺盤孢屬（Colletotrichum）為優(yōu)勢類群，共12株，占分離菌株總數(shù)的41.37%;而菌株A797和A805與最相似物種的相似度較低，分別是96.3%和93.3%，有待進(jìn)一步鑒定。

3.2?內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌活性?29株內(nèi)生真菌中有9個(gè)屬11株真菌的提取物至少對1種供試細(xì)菌有抗菌活性（抑菌圈直徑≥8?mm），占分離菌株總數(shù)的37.9%，對2種供試細(xì)菌有抑制作用的活性菌株有3株，占分離菌株總數(shù)的10.3?%。其中對SA和BS都具有較好抑制活性（抑菌圈直徑≥13?mm）的菌株有3株，分別是菌株A797、A798和A809;所有內(nèi)生真菌的提取物對大腸桿菌均沒有明顯的抑制作用。見表2。

3.2?內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性?各菌株發(fā)酵液粗提物的體外細(xì)胞毒活性測試結(jié)果見表3。從表3中可以看出，當(dāng)粗提物的濃度為100μg/mL時(shí)，29株內(nèi)生真菌中共有6個(gè)屬10株真菌提取物至少對1種供試細(xì)胞株有抑制作用（抑制率≥50%以上），占分離菌株總數(shù)的?34.5%;對4株受試腫瘤細(xì)胞均具有顯著活性（抑制率≥90%以上）的菌株有3株，分別是菌株A781、A785和A805。

4?討論

紅千層屬植物的化學(xué)成分和生物活性已有大量的研究報(bào)道。本研究首次對垂枝紅千層的內(nèi)生真菌多樣性及其生物活性進(jìn)行探索，從中分離獲得了29株內(nèi)生真菌，經(jīng)ITS序列分析鑒定為17屬20種，其中以黑孢霉屬、刺盤孢屬和間座殼屬為優(yōu)勢類群。通過對內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物的抗細(xì)菌和抗腫瘤活性測試，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)屬11株真菌提取物至少對1種供試細(xì)菌有抗細(xì)菌活性（抑菌圈直徑≥8mm），其中菌株P(guān)seudofusicoccum?violaceum?A797、Amesia?gelasinospora?A798和Botryosphaeria?dothidea?A809的發(fā)酵提取物，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有較好抑制活性（抑菌圈直徑≥13mm）;細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)生真菌粗提物濃度為100μg/mL時(shí)，共有6個(gè)屬10株真菌提取物至少對1?種受試細(xì)胞株有抑制作用（抑制率≥50%?以上），其中菌株Guignardia?mangiferae?A781、Nigrospora?sphaerica?A785和Diaporthe?phaseolorum?A805對SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2?4種受試細(xì)胞的抑制率均在90%以上。結(jié)果表明，垂枝紅千層內(nèi)生真菌具有較為豐富的物種多樣性，且部分菌株具有較好的生物活性，為進(jìn)一步研究垂枝紅千層內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，并為開發(fā)利用垂枝紅千層資源提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-09-24?編輯：劉?斌）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目?（31600271）;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2107A020211023）;廣州市珠江科技新星項(xiàng)目?（201806010080）。

作者簡介：李賽妮（1991-），女，漢族，本科，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與應(yīng)用技術(shù)。E-mail：1119606031@qq.com

通信作者：章衛(wèi)民（1965-），男，漢族，博士，研究員，研究方向?yàn)樗幱梦⑸镔Y源及其活性物質(zhì)研究。E-mail：wmzhang58@qq.com