關(guān)節(jié)滑液檢測在關(guān)節(jié)假體周圍感染診斷中的研究進(jìn)展*

邢賽 彭昊*

關(guān)節(jié)假體周圍感染（periprosthetic joint infection，PJI）是關(guān)節(jié)置換術(shù)后可能出現(xiàn)的僅次于假體松動(dòng)的第二大常見并發(fā)癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，美國每年人工髖、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生感染的概率分別為2.0%、2.4%，而在歐洲分別為1.2%、0.8%[2-3]。關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生感染，會(huì)造成關(guān)節(jié)疼痛腫脹，嚴(yán)重的會(huì)有竇道形成，膿液流出，繼而引起關(guān)節(jié)假體松動(dòng)，假體使用壽命大大縮短。而且感染后治療非常復(fù)雜，目前處理原則是一期行關(guān)節(jié)曠置術(shù)，二期行關(guān)節(jié)翻修術(shù)。多次手術(shù)和長時(shí)間的治療周期將成倍增加患者的痛苦和治療費(fèi)用。遺憾的是，目前對于PJI的診斷，還沒有一種可以被普遍接受的可靠方法[4]。因?yàn)樵谂R床實(shí)踐中，臨床病史和檢查并不總是能夠區(qū)分感染和無菌性松動(dòng)，只有少數(shù)PJI病例具有典型的與關(guān)節(jié)相通的竇道。此外，血清標(biāo)志物（如 C-反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率）在某些病例的診斷效率往往有限。再者由于大多數(shù)慢性PJI病例存在生物膜，且患者在采集培養(yǎng)標(biāo)本前曾給予抗生素治療，使得培養(yǎng)的假陰性率升高。

目前最被認(rèn)可的PJI診斷標(biāo)準(zhǔn)是由美國骨肌系統(tǒng)感染協(xié)會(huì)在2011年制定的，該指南由兩部分組成：2項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)：與假體相通的竇道形成；2個(gè)以上的假體周圍組織標(biāo)本培養(yǎng)出同一種病原菌。6項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)：ESR和CRP升高，關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，關(guān)節(jié)液多形核細(xì)胞比例升高，存在膿液，1次細(xì)菌培養(yǎng)陽性，5個(gè)高倍鏡視野中每一個(gè)的中性粒細(xì)胞數(shù)均大于5個(gè)。滿足2項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)中的1項(xiàng)或者6項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)中的4項(xiàng)，就可做出診斷[5]。從中可以看出關(guān)節(jié)液指標(biāo)占有很大的比重，首先穿刺細(xì)菌培養(yǎng)仍然是篩查特定微生物最有效的方法。然而，雖然從關(guān)節(jié)滑液和組織中可以培養(yǎng)出微生物，但是缺乏敏感性，而且培養(yǎng)結(jié)果是陰性的情況下，也不能排除PJI。因此，實(shí)驗(yàn)室關(guān)節(jié)滑液培養(yǎng)的分析有待進(jìn)一步提高。其次，當(dāng)高度懷疑PJI，需行關(guān)節(jié)穿刺抽取關(guān)節(jié)滑液測定WBC的數(shù)目，關(guān)節(jié)滑液的WBC增高往往提示有PJI。最近多項(xiàng)研究表明，關(guān)節(jié)滑液中的WBC對于關(guān)節(jié)假體周圍感染具有較高的敏感性和特異性。如果關(guān)節(jié)滑液中的WBC＞1700cell/L，并且中性粒細(xì)胞的百分比＞60%～65%，就高度懷疑 PJI[6]。最后，對于冰凍切片診斷標(biāo)準(zhǔn)存在爭議。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)如果把每高倍鏡下發(fā)現(xiàn)5個(gè)中性粒細(xì)胞定義為陽性，診斷敏感性尚可，但是特異性較低，而且假陽性率較高[7]。近年來關(guān)節(jié)滑液指標(biāo)也是受到廣泛研究，其中關(guān)節(jié)滑液CRP、-防御素、白細(xì)胞酯酶（leukocyteesterase，LE）、關(guān)節(jié)滑液白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)和多形核細(xì)胞計(jì)數(shù)（PMN%）、分子生物學(xué)手段如PCR技術(shù)等展現(xiàn)出了良好的診斷價(jià)值。本文就對這些最新的滑液標(biāo)志物及其檢測方法作一綜述。

1 關(guān)節(jié)滑液白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)及多形核細(xì)胞計(jì)數(shù)（PMN%）

滑膜液WBC計(jì)數(shù)和PMN%是感染早期就會(huì)出現(xiàn)變化的指標(biāo)，也是診斷PJI的生物標(biāo)志物之一。目前許多組織提供的PJI診斷指南，也都包括了滑膜液WBC計(jì)數(shù)和PMN%。但是關(guān)于滑膜液 WBC計(jì)數(shù)和 PMN%的診斷閾值的數(shù)據(jù)很少，所以現(xiàn)在對其研究重點(diǎn)在于確定其閾值。KimSang-Gyun等[8]通過回顧性研究確定了滑膜WBC計(jì)數(shù)2個(gè)最佳截?cái)嘀担?dāng)滑膜WBC截?cái)嘀禐?1 200 cell/L，診斷急性PJI的靈敏度最高（100%），特異性最高（98.9%），當(dāng)截?cái)嘀禐?6 000 cell/L時(shí)，最佳陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100%和99.5%。Hoiby等[9]確定了PMN%的最佳截?cái)嘀翟谌リP(guān)節(jié)置換術(shù)后和全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后分別為 60.5%和66.1%。此兩個(gè)研究所得到的閾值都來源于小樣本，具有一定的參考意義，仍需多中心、大樣本量的研究證據(jù)支持。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)在閾值附近時(shí)，診斷的準(zhǔn)確性將大幅下降[10]。因此在臨床應(yīng)用時(shí)要注意區(qū)分膝關(guān)節(jié)還是髖關(guān)節(jié)，因?yàn)閮烧叩拈撝凳遣煌?，還要注意當(dāng)檢測值在閾值附近時(shí)，要聯(lián)合其他指標(biāo)進(jìn)行診斷。除此之外，在金屬對金屬假體功能障礙和存在腐蝕反應(yīng)情況下，由于含有吞噬金屬顆粒的單核細(xì)胞會(huì)干擾某些實(shí)驗(yàn)室儀器，會(huì)導(dǎo)致滑膜液WBC計(jì)數(shù)和 PMN%的結(jié)果不可靠[11-12]。以往使用抗生素也會(huì)對滑膜WBC計(jì)數(shù)和PMN%的診斷價(jià)值產(chǎn)生負(fù)面影響[13]。

2 關(guān)節(jié)滑液CRP

CRP是一種長期存在于血清中的蛋白質(zhì)，作為感染的一種指標(biāo)，它已經(jīng)在臨床上被廣泛應(yīng)用。當(dāng)感染發(fā)生時(shí)，升高的血清CRP向關(guān)節(jié)的擴(kuò)散可能導(dǎo)致滑膜液CRP升高，局部CRP可以增強(qiáng)補(bǔ)體激活和吞噬作用，是CRP發(fā)揮抗菌作用的理論依據(jù)[14-15]。Parvizi等[16]基于以上理論設(shè)計(jì)了對63例翻修或初次關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)感染組與非感染組的滑膜CRP平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.0001），且在閾值9.5 mg/L時(shí)，敏感性為85%，特異性為95%。這與許多研究得出的結(jié)果相似，表明滑液CRP對于PJI的診斷具有較高的敏感性和特異性。但是也有4%的感染者滑液CRP表現(xiàn)正常，使其在單獨(dú)診斷PJI時(shí)受到質(zhì)疑[12]。因此，與其他指標(biāo)聯(lián)合診斷是一個(gè)新的趨勢，其中與血清IL-6聯(lián)合診斷的價(jià)值相對較高。當(dāng)滑膜CRP與血清IL-6聯(lián)合檢測時(shí)，同時(shí)陽性幾乎排除了PJI的假陰性檢測[17]。當(dāng)與滑液標(biāo)志物聯(lián)合時(shí)能顯著糾正假陽性，Deirmengian等[18]對 -防御素進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)存在5例假陽性，但是當(dāng)聯(lián)合滑液 CRP時(shí)，5例假陽性得以糾正。說明滑液CRP與其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)聯(lián)合時(shí)可能具有更高的診斷價(jià)值。

3.2 -防御素的檢測方法

測量滑膜液中的 -防御素有兩種方法：基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的免疫測定法和基于側(cè)向流動(dòng)裝置的側(cè)向流動(dòng)測定法。Bonanzinga等[24]利用免疫測定法進(jìn)行了前瞻性研究， -防御素免疫測定的敏感性為97%，特異性為97%，陽性預(yù)測值為88%，陰性預(yù)測值為99%。Berger等[25]利用側(cè)向流動(dòng)測定法進(jìn)行研究，側(cè)向流動(dòng)測定的靈敏性為97.1%，特異性為 96.6%。陽性預(yù)測值為 91.7%，陰性預(yù)測值為98.8%。 -防御素的兩種檢測方法都展現(xiàn)出了超高的敏感性和特異性，但不是對比研究，并不能說明哪種方法更有優(yōu)勢。最近一篇研究對兩種檢測方法的薈萃分析顯示側(cè)流試驗(yàn)的合并敏感性（0.774）和特異性（0.913）均低于免疫定性分析的合并敏感性（0.953）和特異性（0.965）[26]。但是與免疫測定法相比，側(cè)流檢測裝置已有商品化的試劑盒出現(xiàn)，其檢測方便、快捷，而且價(jià)格更容易被患者接受等優(yōu)點(diǎn)[27]。因此，側(cè)向流動(dòng)法雖然靈敏性和特異性稍低，但是更適合臨床應(yīng)用。

4 白細(xì)胞酯酶

白細(xì)胞酯酶（leukocyte esterase，LE）主要存在于中性粒細(xì)胞內(nèi)，是中性粒細(xì)胞分泌的一種特異性酶，人體其他白細(xì)胞不會(huì)分泌此酶，所以可以通過檢測此酶，來確定是否存在大量中性粒細(xì)胞，確定是否存在感染。因此，2014年美國骨肌系統(tǒng)感染協(xié)會(huì)也把LE和關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)一同加入診斷PJI的次要標(biāo)準(zhǔn)之中[28]。Wetters等[29]利用LE比色試紙直接檢測關(guān)節(jié)液，其敏感性為92.9%，特異性為88.8%?？梢哉J(rèn)為關(guān)節(jié)液LE比色試紙是診斷PJI的敏感工具，而且其快速、簡便、廉價(jià)，但是同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其容易受到滑膜液中的血液或碎片污染而無法閱讀，使其在應(yīng)用時(shí)受到了很大的局限性。Aggarwal等[30]描述了一種簡單、廉價(jià)和有效的方法能有效避免血液的干擾，就是關(guān)節(jié)滑液離心后再進(jìn)行LE試紙檢測。結(jié)果在所有的病例中，無論是化膿性的還是無菌的，滑膜液離心后 LE試紙?jiān)囼?yàn)與直接試紙比色的結(jié)果是100%一致的。表明LE測試的準(zhǔn)確性不受離心影響，為進(jìn)一步研究提供了可靠的方向。此外，對于LE的測定還有尿LE試紙，通過尿中LE水平來反映關(guān)節(jié)液中的LE的水平，并以此輔助診斷PJI。但是研究發(fā)現(xiàn)，尿LE試紙的靈敏度較低，常常無法檢測出滑膜液中豐富的LE水平，不能排除PJI[31]。

5 滑液細(xì)菌基因片段檢測

滑液細(xì)菌基因片段檢測是近年來被廣泛研究的診斷PJI的一種新方法，其利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對所采集的關(guān)節(jié)液進(jìn)行核酸擴(kuò)增試驗(yàn)，直接檢測病原體的DNA和RNA，可以避免抗生素的影響，而且非?？焖佟３Ｒ?guī)PCR是對細(xì)菌DNA進(jìn)行測定，由于細(xì)菌生物膜的存在，敏感性和特異性較低，甚至低于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)[32]。而超聲處理破壞細(xì)菌生物膜后再進(jìn)行PCR檢測，其敏感性和特異性明顯優(yōu)于培養(yǎng)，甚至高于超聲處理液培養(yǎng)，在引起假體周圍感染的致病菌是低毒致病菌時(shí)，優(yōu)勢更加明顯[33-34]。除此之外，多重PCR及逆轉(zhuǎn)錄PCR也被證實(shí)能夠提高PCR診斷準(zhǔn)確性。

5.1 多重引物PCR技術(shù)

多重引物PCR技術(shù)顧名思義就是聯(lián)合應(yīng)用多組特異性引物，每組引物都可以與細(xì)菌DNA不同區(qū)域的特定靶點(diǎn)相結(jié)合，可以有效避免常規(guī)PCR使用單一引物檢測所造成的敏感性和特異性低的問題。一項(xiàng)利用多重PCR技術(shù)對被確診為PJI患者進(jìn)行感染和病原菌檢測的小樣本研究發(fā)現(xiàn)：多重引物 PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對感染及病原菌100%的診斷[35]。雖然是小范圍研究，結(jié)果的可靠性有待商榷，但是其可以表明多重PCR對提高診斷的準(zhǔn)確性還是有積極的意義。由于目前多重引物PCR技術(shù)的研究還不夠完善，缺點(diǎn)也很明顯。就目前報(bào)道來看，多重引物PCR技術(shù)最大的缺點(diǎn)是診斷敏感性和特異性不能兼?zhèn)鋄36]。

5.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)通過RNA而非DNA診斷感染。之所以逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)能提高診斷準(zhǔn)確性是因?yàn)榧?xì)菌DNA結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定、半衰期長、不易降解，容易受到死亡細(xì)菌的影響，造成假陽性率增高，而細(xì)菌RNA則恰恰相反，因此不易受到死亡細(xì)菌的影響，準(zhǔn)確性和可靠性較高[37]。Fang等[38]對疑似發(fā)生PJI并最終行翻修關(guān)節(jié)成形術(shù)且符合納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行術(shù)前穿刺或術(shù)中采集，獲得滑膜液。對每個(gè)滑膜液樣本進(jìn)行基于DNA和RNA的PCR分析，比較兩種PCR方法的診斷效率。得出基于DNA的PCR檢測對于抗生素治療后的可疑PJI患者具有較高的敏感性，基于RNA的PCR可降低DNA檢測的假陽性率。細(xì)菌RNA分為三種即rRNA、mRNA、tRNA。目前研究最深入的是16s rRNA和23srRNA。因?yàn)閞RNA是細(xì)菌RNA中含量最多且分子量最大的，比較容易檢測。其次細(xì)菌內(nèi)mRNA的合成量非常少且在離體提取過程中，大量的 mRNA很快就會(huì)被降解，大多時(shí)候檢測不到，導(dǎo)致診斷敏感性不高，而rRNA相對較穩(wěn)定，經(jīng)提取過程后仍可保持高濃度[39]。最后是不同種類細(xì)菌的rRNA與mRNA在結(jié)構(gòu)上有很大不同，細(xì)菌rRNA結(jié)構(gòu)上存在特異的高度保守區(qū)域，不同的細(xì)菌其保守區(qū)域是不同的，因此通過檢測保守區(qū)域的目的基因可以區(qū)別不同的細(xì)菌。而不同細(xì)菌的mRNA結(jié)構(gòu)上幾乎不存在相類似的特異性保守區(qū)域，對不同的細(xì)菌沒有辨別作用。細(xì)菌內(nèi)的rRNA也分為三種，分別為5s rRNA、16s rRNA、23s rRNA，其中5s rRNA僅含有120個(gè)核苷酸，相對分子量太小不便于實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行序列分析，所以有關(guān)此方面的研究，大多選取16s rRNA和23s rRNA作為研究對象。

6 總結(jié)

與傳統(tǒng)血清學(xué)檢測、影像學(xué)檢查相比，關(guān)節(jié)滑液檢測對于PJI的診斷有著巨大的優(yōu)勢?；簶?biāo)志物具有較高的敏感性和特異性，診斷的假陽性率及假陰性率較低，診斷的準(zhǔn)確性較目前臨床常用指標(biāo)較高?；簶?biāo)志物也較少受到全身情況和使用抗生素的影響，同時(shí)也可以直接對病原體進(jìn)行檢測，能夠早期診斷并及時(shí)給予相應(yīng)治療，這能顯著改善PJI患者的預(yù)后。但是目前滑液標(biāo)志物的研究還不完善，還有許多不足之處。有些滑液標(biāo)志物只能在翻修術(shù)中獲取，不能指導(dǎo)術(shù)前診斷，合理安排治療方案。其次是有些檢測方法還不夠成熟，在對結(jié)果的解釋時(shí)存在爭議，不適于臨床應(yīng)用，而且有些檢測需要的成本較高，對于非大型醫(yī)院及貧困患者來說，負(fù)擔(dān)不起。目前，滑液標(biāo)志物的研究有相當(dāng)部分是小樣本量的研究，結(jié)論的可靠性受到質(zhì)疑。因此，未來滑液標(biāo)志物的研究應(yīng)該趨向于多中心、大樣本量的研究，同時(shí)在對其檢測方法在保證準(zhǔn)確性的前提下應(yīng)該趨向于適用臨床。滑液標(biāo)志物相互聯(lián)合或者與血清學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合也是一個(gè)重要的方向，應(yīng)該深入研究，并加大對 -防御素的研究，這是目前最有價(jià)值的滑液標(biāo)志物。