非編碼RNA調(diào)節(jié)異常在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用

劉樹業(yè)

劉樹業(yè)，天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津市 300170

核心提要：研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移中作用重要，具較強(qiáng)診斷和治療潛力，利于精準(zhǔn)診療.但這些研究仍處于起步階段，進(jìn)一步研究肝臟ncRNAs與疾病進(jìn)展的關(guān)系將是解決包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的肝臟疾病的關(guān)鍵.

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見惡性腫瘤之一，惡性程度極高，侵襲能力強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，嚴(yán)重危害人類健康.HCC是多種基因突變包括表觀遺傳改變、染色體易位、缺失和增加等都存在的復(fù)雜疾病，其產(chǎn)生的確切分子機(jī)制尚不完全清楚.HCC細(xì)胞極易侵襲門靜脈系統(tǒng)形成癌栓，HCC門靜脈癌栓的形成是影響HCC預(yù)后的重要因素.HCC起病隱匿，早期缺乏明顯的臨床癥狀，研究發(fā)現(xiàn)高效的HCC標(biāo)志物有助于診斷HCC，提高療效，改善預(yù)后.目前HCC的診斷主要依靠甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)和影像學(xué)技術(shù).然而，AFP敏感性較低，診斷早期HCC的能力有限[1].近來有證據(jù)表明非編碼RNA(Non-coding RNAs，ncRNAs)與HCC的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療和預(yù)后等密切相關(guān)，可作為HCC早期診斷的新型分子標(biāo)志物和新的有效治療靶點(diǎn).

HCC發(fā)生過程復(fù)雜.肝臟多次暴露于非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、酗酒和病毒感染等容易引起纖維化和肝硬化的疾病后，經(jīng)過一系列不良增生和發(fā)育變化，最終發(fā)展成HCC.從微觀角度看，HCC則是癌基因和抑癌基因在細(xì)胞增殖、血管生成、凋亡、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移等過程中的調(diào)控紊亂所致.其中，c-MET信號(hào)通路[2]、磷脂酰肌3-激酶(PI3 K/Akt/mTOR通路)[3]、Wnt/β-catenin通路[4]、TGF-β信號(hào)路徑[5]等是影響細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子通路.

ncRNAs是由DNA轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA.ncRNAs通過與DNA或RNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，導(dǎo)致其基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中降解或改變[5].ncRNAs作為一類特殊的RNA分子，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環(huán)狀RNA(circle RNA，circRNA)，具有調(diào)控基因表達(dá)、參與表觀遺傳修飾、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等多種生命活動(dòng)的功能，參與生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、免疫，甚至在腫瘤的形成等多種生物學(xué)進(jìn)程.

ncRNAs在HCC中的研究是目前比較前沿的研究領(lǐng)域，現(xiàn)就ncRNAs(主要包括miRNA、lncRNA和circRNA)在HCC中的研究進(jìn)展進(jìn)行述評(píng).

1 miRNA與HCC

ncRNAs中研究最多的是miRNA，miRNA是一種內(nèi)源性小ncRNAs分子，大約由21-25個(gè)核苷酸組成，主要促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控.原代miRNA通過RNA聚合酶Ⅱ從miRNA基因轉(zhuǎn)錄而來[6].大于60%的蛋白編碼基因的翻譯由miRNA調(diào)控[7].miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和發(fā)育.一個(gè)miRNA能夠抑制多個(gè)基因的表達(dá)，多個(gè)miRNA也能共同作用一個(gè)靶點(diǎn).

miRNA在肝臟中扮演著維持肝臟穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵角色.miRNA失調(diào)與肝臟疾病(如病毒感染、炎癥、脂糖代謝等)相關(guān)，并促進(jìn)HCC進(jìn)展.miR-122，miR-192，miR-21，miR-223，miR-26a，miR-27a and miR-801等7個(gè)miRNA聯(lián)合診斷早期HCC，對(duì)小于2 cm的HCC診斷準(zhǔn)確率接近90%，效果優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法[8].

1.1 miRNA促進(jìn)HCC發(fā)生和進(jìn)展 在HCC中，miRNA失調(diào)導(dǎo)致靶基因異常表達(dá)，促進(jìn)異常細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、血管生成導(dǎo)致HCC的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移.肝細(xì)胞特異性Dicer-1 KO小鼠自發(fā)形成HCC意味著肝臟miRNA在HCC中發(fā)揮重要生物學(xué)作用[9].此外，Dicer-1 KO小鼠肝臟中4種肝臟特異性miRNA(miR-122、-148a、-192和-194)明顯下調(diào).

在肝細(xì)胞中，miR-122對(duì)維持肝細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)等生理功能至關(guān)重要[10].miR-122 KO小鼠在經(jīng)歷肝炎、脂肪肝、纖維化后，發(fā)展為自發(fā)性HCC[11].在NASH嚙鼠模型中，miR-122水平在HCC發(fā)生和進(jìn)展過程中降低[12]，其靶基因，包括ADAM10、血清應(yīng)答因子、胰島素類生長(zhǎng)因子1受體[13]和Wnt1[14]，參與HCC進(jìn)展.在HCC患者中，miR-122低表達(dá)與不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]，其缺失促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲等運(yùn)動(dòng)特性.此外，miR-122和c-Myc之間的負(fù)反饋循環(huán)促進(jìn)HCC進(jìn)展.miR-122通過靶向調(diào)節(jié)Tfdp2和E2f1來抑制c-Myc的表達(dá)，而c-Myc則通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-122表達(dá)[16].miR-122還通過靶向調(diào)控Snail1和Snail2以及抑制Wnt/b-catenin通路，抑制HCC中的EMT[17]，過表達(dá)miR-122可減弱EMT啟動(dòng)子基因Ga12對(duì)c-Met、ERK、STAT3、Akt/mTOR通路的影響，抑制HCC的增殖和凋亡[18].

miR-148a抑制與HCC中a-胎蛋白水平高、TNM分期差、無復(fù)發(fā)生存率低有關(guān).門靜脈腫瘤血栓患者中miR-148a水平下降[19].研究發(fā)現(xiàn)miR-148a在HCC微血管浸潤(rùn)患者中水平也比較低.小鼠miR-148a缺失促進(jìn)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)HCC形成[20].同樣，肝臟PTEN缺失的小鼠miR-148a過表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)[21].此外，miR-148a失調(diào)與HCC預(yù)后不良有關(guān).在原位肝移植模型中，miR-148a上調(diào)通過直接抑制c-Met進(jìn)而抑制EMT和細(xì)胞侵襲，減少鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的核積聚[15]，抑制細(xì)胞向肺部遷移；其降低導(dǎo)致HPIP/AKT/ERK/FOXO4/ATF5/mTOR通路激活，促進(jìn)EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移[14].而miR-148a靶點(diǎn)之一的USP4過表達(dá)通過激活TGF-b通路促進(jìn)HCC進(jìn)展[22].

miR-192失調(diào)與HCC預(yù)后不良相關(guān)[23].HCC患者miR-192水平降低，在微血管浸潤(rùn)或腫瘤體積較大的標(biāo)本中miR-192水平更低[18].miR-192通過靶向溶質(zhì)載體家族39成員6(SLC39A6)抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移，進(jìn)而上調(diào)E-cadherin，下調(diào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)；以轉(zhuǎn)錄后方式抑制lncRNA HOTTIP表達(dá)，降低HCC細(xì)胞生存能力[24]；抑制p53介導(dǎo)的ZEB2，抑制HCC細(xì)胞中EMT[25].Mir-194監(jiān)管肝臟Wnt配體的膜受體信號(hào)Fzd6.體外實(shí)驗(yàn)顯示miR-194在肝上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的FXR-/-HCC模型中表達(dá)水平降低[26].研究發(fā)現(xiàn)miR-194抑制多個(gè)與EMT和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(如CDH2和RAC1).另外，HNF1a是肝細(xì)胞功能的重要調(diào)控因子，其過表達(dá)可重建miR-192、194等肝臟特異性基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖[27].

1.2 miRNA在HCC臨床應(yīng)用中的意義 miRNA可作為HCC的重要預(yù)后標(biāo)志物.比如miR-122水平與HCC的腫瘤大小和轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)[28]，miR-148a失調(diào)與HCC患者生存率降低有關(guān)[29].miR-192也是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[23].miR-194的降低與HCC患者腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)存在顯著相關(guān)性[29].此外，miR-199a可作為HCC患者無瘤生存降低的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子.miR-135a上調(diào)在HCC門靜脈腫瘤血栓中得到證實(shí)[30].

血清miR-221水平升高與HCC患者腫瘤大小、TNM分期和總生存率相關(guān).此外，循環(huán)miR-221水平與晚期HCC患者索拉非尼治療反應(yīng)相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)治療反應(yīng)率[31].在血液標(biāo)本中，miR-21、miR-148a、miR-192和miR-224對(duì)HCC具有顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值[32].HCC患者血清中miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375水平升高，可診斷早期HCC[33].miR-15b和miR-130b水平也升高[31]，與HCC傳統(tǒng)血清標(biāo)志物相比，血清miR-16敏感性更高[34].

隨研究進(jìn)展，專注于調(diào)控miRNA的策略將是治療HCC的一種新方法.多種miRNA在不同肝臟疾病中的調(diào)控已顯示出其在治療HCC中的潛在有效性.miR-122是一種肝特異性腫瘤抑制因子，向miR-122 KO小鼠中注射miR-122a表現(xiàn)為HCC癌變和進(jìn)展受損，上調(diào)miR-122可能是一種成功治療HCC的策略[35].另一項(xiàng)研究證實(shí)，瘤內(nèi)注射miR-122能增強(qiáng)異種移植模型中索拉非尼對(duì)HCC的抗腫瘤作用[36].此外，miR-26a在HCC小鼠模型中通過誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞周期阻滯和凋亡抑制腫瘤發(fā)生.相反，通過釋放anti-miR-221寡核苷酸抑制致癌基因miR-221可使腫瘤生長(zhǎng)顯著下降[37].

2 lncRNA與HCC

LncRNA長(zhǎng)度超過200nt，轉(zhuǎn)錄和處理與蛋白編碼基因相同，是哺乳動(dòng)物非編碼轉(zhuǎn)錄組的主要組成部分.其保守性差，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚[38].近年來大量研究表明lncRNA通過在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳水平參與基因的表達(dá)調(diào)控，并以此影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程，與HCC發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制及患者預(yù)后密切相關(guān).因此lncRNA有潛力作為疾病診斷的標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)，研究成果將有助于開發(fā)新型靶向治療方案，意義重大.

2.1 lncRNA與HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 HULC是高度保守的lncRNA，也是HCC中上調(diào)最多的基因.HULC與HCC患者的PTEN、miR-15a表達(dá)負(fù)相關(guān)，促進(jìn)惡性進(jìn)展[39].HULC作為miR-9、miR-107和miR-372等miRNA海綿，分別誘導(dǎo)PPARA、E2F1和CREB，從而促進(jìn)HCC發(fā)展[40].lncRNA MALAT1在HCC中上調(diào)，通過上調(diào)SRSF1和激活mTOR通路發(fā)揮致癌基因的作用[41].

相比之下，人類母系表達(dá)基因3(MEG3)、AOC4P和DREHL ncRNA具有腫瘤抑制作用.MEG3被認(rèn)為是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素，因?yàn)榕cHCC患者中MEG3的高表達(dá)相比，MEG3的低表達(dá)與較差的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)[42].MEG3過表達(dá)明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，激活細(xì)胞凋亡[43].同樣，在HCC患者中AOC4P表達(dá)顯著抑制，與TNM分期、包膜浸潤(rùn)、血管浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)[44].

LncRNA在EMT和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用.LncRNA-NEF被EMT抑制因子FOXA2轉(zhuǎn)錄激活，顯著抑制EMT和細(xì)胞遷移[45].LncRNA CPS1-IT1通過抑制HIF-1a和抑制EMT發(fā)揮抑癌作用[46].ZEB1-as1通過上調(diào)ZEB1促進(jìn)EMT和轉(zhuǎn)移[47]，在HCC樣本尤其是轉(zhuǎn)移瘤組織中升高.

HULC還通過與miR-200a競(jìng)爭(zhēng)，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[48].Jang等[48]發(fā)現(xiàn)HULC的表達(dá)與TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、HCC復(fù)發(fā)和術(shù)后生存相關(guān).LncRNAATB在HCC組織中也顯著升高，且與肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移呈正相關(guān).Li等[49]研究發(fā)現(xiàn)，LINC01138高表達(dá)的HCC患者腫瘤體積較大，且高表達(dá)與HCC患者的AFP含量以及乙肝表面抗原陽性呈正相關(guān)，而且高表達(dá)HCC患者預(yù)后較差.體外與體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)揭示LINC01138可以顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力.Zhang等[50]在HCC中通過RNA-Seq的方法鑒定到了一種腫瘤特異性的LIN28B轉(zhuǎn)錄本變異體LIN28B-TST，并且發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控，該轉(zhuǎn)錄本編碼一種具有外加N端氨基酸序列的蛋白異構(gòu)體，對(duì)于促進(jìn)腫瘤的增殖生長(zhǎng)具有重要作用.

2.2 lncRNA與HCC臨床診治中的潛在應(yīng)用價(jià)值 lncRNA在肝組織中特異性表達(dá).通過meta分析發(fā)現(xiàn)AFAPAS1、HOTTIP、ZEB-1-AS1等27種LncRNA高表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)，GAS5、MEG3、XIST等18種LncRNA低表達(dá)會(huì)加劇惡化[51].

HCC患者HULC水平升高，且與Edmondson組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)[52].UCA1和WRAP53的表達(dá)增加也與腫瘤惡性程度相關(guān).此外，結(jié)合LncRNA和血清AFP聯(lián)合檢測(cè)可提高HCC診斷的敏感性[53].分析血清中uc001ncr和AX800134表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)LncRNA有可能成為診斷HCC的新型標(biāo)志物，尤其當(dāng)早期HCCAFP小于等于400 ng/mL時(shí)[44].

除此之外，RP11-160H22.5、XLOC_014172和LOC149086等3種潛在的診斷l(xiāng)ncRNA也被提出，其中XLOC_014172和LOC149086在轉(zhuǎn)移性HCC患者中均顯著升高[54].總結(jié)出HCC相關(guān)ncRNA，如HULC，Linc00152，HEIH，HOTTIP，HOTAIR，MALAT1，DILC，ZFAS1，MEG3，PRAL，LALR1，LET，MVIH，PCNA-AS，TUC338，UC001NCR.

MRX34是包裹在脂質(zhì)體納米顆粒中的miR-34a合成版本，在一期臨床試驗(yàn)中顯示出HCC抗腫瘤活性[55].第一種miRNA靶向藥物米雷韋森(miravirsen)，一種lna修飾的anti-miR-122 DNA-RNA雜化寡核苷酸，正在進(jìn)行慢性丙肝治療的II期臨床試驗(yàn)[56].

3 環(huán)狀RNA與HCC

circRNA是封閉的環(huán)狀分子，作為ncRNA家族的一部分，circRNA通常以組織和發(fā)育階段特異性方式表達(dá)，而且表達(dá)豐度高.它在疾病的變化發(fā)展中先于蛋白類標(biāo)志物，在血清中表達(dá)很穩(wěn)定，因此它作為HCC早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物具有很好的臨床應(yīng)用前景.

3.1 環(huán)狀RNA在HCC發(fā)生、進(jìn)展中的作用 環(huán)狀RNA在HCC的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用.CDRIas(Hsa_circ_0001946)通過靶向抑制miR-7功能提高HCC細(xì)胞的增殖能力[57]；circMT01(Hsa_circ_0007874)通過充當(dāng)miR-9的分子海綿進(jìn)而提高P21表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑癌作用[58]；circRNA_000839(Hsa circ_0000497)可能通過與miR-200b和RhoA的相互作用影響HCC發(fā)生和發(fā)展[59]；circITC H通過抑制Wnt/p -Catenin pathway信號(hào)通路抑制HCC[60].Hsa circ_0001649可通過靶向SHPRH基因來發(fā)揮其抑制HCC的作用[61]CircHIPK3(Hsa_circ_0000284)可以作為miR-124的分子海綿促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)[62]；與HCC的發(fā)生密切相關(guān)的circFUT8(Hsa_circ_0003028)，circZFR(Hsa circ_103809)以及circIP011(Hsa circ_0007915)可靶向多個(gè)miRNA發(fā)揮作用[63]；cSMARCAS(Hsa_circ_0001445)通過充當(dāng)miR-17-3p和miR-181b-5p的分子海綿促進(jìn)抑癌基因TIMP3的表達(dá)，從而抑制HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；CircC3P1通過對(duì)miR-4641的海綿作用促進(jìn)PCK1的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑制HCC生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用[64].

3.2 環(huán)狀RNA在HCC診斷與治療中的應(yīng)用 circRNA有望成為理想的HCC分子標(biāo)志物.Yao等[65]通過建立受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評(píng)估circZKSCANI(Hsa_circ_0001727)在鑒別HCC組織及鄰近正常組織時(shí)的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其受試者工作特征曲線下面積((area under curve，AUC)為0.834，靈敏度為82.2%，特異度為72.4%；Qin等[66]通過ROC曲線評(píng)估Hsa_circ_0001649在鑒別HCC組織及鄰近正常組織的AUC為0.63，靈敏度為0.81，特異度為0.69.Shang等[67]發(fā)現(xiàn)Hsa circ_0005075鑒別HCC組織和癌旁正常組織時(shí)AUC為0.94，靈敏度為83.3%，特異度為90.0%；ROC曲線評(píng)估血漿Hsa circ_0001445診斷HCC患者較AFP具有更高的靈敏度，在鑒別HCC患者和正常人時(shí)其AUC為0.862，靈敏度為71.2%，特異度為94.2%.

另外，Hsa_circ_0016788可以通過miR-486/CDK4信號(hào)通路促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)，表明Hsa_circ_0016788在HCC治療中具有很大的研究?jī)r(jià)值[68].Hsa circ_0067934可以通過抑制miR-1324的功能以及激活FZD5/β-catenin信號(hào)通路提高HCC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲的能力，提示Hsa_circ_0067934/miR-1324/FZD5/β-catenin信號(hào)軸有望成為HCC治療的新靶標(biāo)[69].

4 結(jié)論

ncRNAs的異常表達(dá)與人類各種疾病尤其與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，相關(guān)研究已成為當(dāng)今HCC研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重要科學(xué)問題.近年研究對(duì)ncRNAs在人類惡性腫瘤特別是HCC中的作用、分子機(jī)制及臨床意義進(jìn)行了深入系統(tǒng)的探索，取得系列創(chuàng)新性研究成果，充分揭示ncRNAs不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而且可作為癌癥診斷與分型、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物；另外，ncRNAs還可以作為癌癥治療靶標(biāo)及新的治療手段，為腫瘤精準(zhǔn)診斷與精準(zhǔn)治療帶來新的機(jī)遇.

然而，ncRNAs數(shù)量繁多，大部分ncRNAs功能及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步明確.雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與HCC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的ncRNAs.而且，幾種基于ncRNAs的癌癥治療方法已在臨床試驗(yàn)中得到檢驗(yàn)，但這些研究仍處于起步階段.因此，進(jìn)一步研究肝臟ncRNA與疾病進(jìn)展的關(guān)系將是解決包括HCC在內(nèi)的肝臟疾病的關(guān)鍵.