綠色木霉對(duì)花生黃曲霉毒素污染的防治

徐楊玉，劉付香，洪彥彬，陳小平，李海芬，溫世杰，李杏瑜，周桂元，梁炫強(qiáng)

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，廣州 510640；2.廣東農(nóng)墾熱帶農(nóng)業(yè)研究院有限公司， 廣州 511365；3.廣東省中山市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，廣東 中山 528404)

20世紀(jì)60年代，英國(guó)報(bào)道的10萬(wàn)只火雞中毒事件，讓人們第一次認(rèn)識(shí)到了黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)的嚴(yán)重危害。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AFT開(kāi)展了大量深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)AFT是由曲霉屬真菌(Aspergillus)特別是黃曲霉(A.flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)分泌的一類(lèi)以二呋喃香豆素為基本構(gòu)成的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，同時(shí)特異曲霉(Aspergillusnomius)、假溜曲霉(Aspergilluspseudotamarii)、Aspergillusbombycis、Emericellaastellata等其他曲霉真菌同樣可以產(chǎn)生AFT[2-6]。黃曲霉具有繁殖速度快、孢子數(shù)量龐大以及傳播遠(yuǎn)等特點(diǎn)，因此糧食等農(nóng)作物在種植、收獲、貯藏和加工過(guò)程中極易受到AFT污染。花生是我國(guó)主要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，受高溫高濕多雨氣候影響，極易感染黃曲霉，導(dǎo)致AFT污染，嚴(yán)重影響到花生的品質(zhì)、風(fēng)味、外觀及食用安全等，對(duì)人和動(dòng)物具有很強(qiáng)的致癌作用[7]。AFT污染已成為全球花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因子，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和研究的重點(diǎn)課題。近年來(lái)，全球加大對(duì)AFT預(yù)防和控制力度，并制定和實(shí)施了嚴(yán)格的安全限量標(biāo)準(zhǔn)。解決花生AFT污染的方法包括田間管理、病蟲(chóng)害控制及物理化學(xué)生物去毒方法等[8-9], 其中，生物防治AFT污染較物理、化學(xué)等方法具有安全系數(shù)高、特異性強(qiáng)、綠色清潔等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，被視為最具發(fā)展前景和潛力的降解方法[10]。 AFT的生物防治主要以微生物、植物或其產(chǎn)生的代謝物為研究對(duì)象, 篩選多種微生物及藥用植物達(dá)到降解AFT的目的[11]。其中，以具有生物防治潛力的木霉屬(Trichodermaspp.)真菌為典型代表，如哈茨木霉(T.harzianum)、綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、鉤木霉(T.hamatum)以及長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)等[12]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，木霉菌至少對(duì)18屬29種植物病原真菌有拮抗作用[13]。本研究旨在通過(guò)分析生防真菌綠色木霉(T.viride)對(duì)花生黃曲霉的抑菌活性以及AFT污染的降解活性，為研究其活性物質(zhì)的抗菌機(jī)制以及大田生產(chǎn)中防治花生AFT污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與植物供試花生(ArachishypogaeaL.)‘粵油7號(hào)’(感黃曲霉品種)、綠色木霉(Trichodermaviride)均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所花生室提供；黃曲霉(AspergillusflavusL.)菌株GIM3.17 引自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該菌株侵染能力和產(chǎn)毒能力均較強(qiáng)。

1.2 試劑與試劑盒Tween20、氯仿、甲醇、丙酮以及三氯甲烷等試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(Invitrogen) 、黃曲霉毒素B1含量測(cè)定酶聯(lián)免疫定量測(cè)試盒(ELISA KIT)購(gòu)自江蘇省微生物研究所。

1.3 常用溶液與培養(yǎng)基PD液體培養(yǎng)基(PDA 固體培養(yǎng)基另加瓊脂15 g·L-1)∶200 g·L-1馬鈴薯、 20 g·L-1葡萄糖，加ddH2O，pH6.8，115 ℃高壓滅菌20 min。PBS緩存液∶15 g十二水磷酸氫二鈉、1 g 磷酸氫二鉀、40 g氯化鈉、1 g 氯化鉀，定容至5 L，pH 7.0。

1.4 平皿拮抗作用-兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法將綠色木霉和黃曲霉菌種在PDA培養(yǎng)基中28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，分別吸取5 mL 0.05%的Tween20溶液，加入到2個(gè)培養(yǎng)菌種的斜面中，充分振蕩，用滅菌濾紙過(guò)濾到2個(gè)50 mL高壓滅菌的三角瓶中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液稀釋到1.0×105mL-1，做好標(biāo)記，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將相同?shù)目的綠色木霉孢子和黃曲霉孢子使用點(diǎn)接種法接種于同一PDA平板中，兩者相距2 cm，置于28 ℃下進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，每天觀察記錄結(jié)果，并測(cè)量拮抗帶寬度。

1.5 不同培養(yǎng)時(shí)間的綠色木霉發(fā)酵液抑制黃曲霉活性的影響將綠色木霉單菌落接種到10 mL新鮮的PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1活化24 h，將活化的菌液全部接種于1 L PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1 ，2 ，3 ，4 ，5，6 ，7，8 d，取出1 mL于1.5 mL離心管中10 000 g離心15 min，保留上清液，用無(wú)菌過(guò)濾器抽濾滅菌，測(cè)定其對(duì)黃曲霉的抑菌活性：將1 μL黃曲霉孢子(3.6×106mL-1)涂布于PDA平板中，28 ℃培養(yǎng)1 d后，孔中加入100 μL無(wú)菌綠色木霉發(fā)酵液(簡(jiǎn)稱(chēng)發(fā)酵液，下同)，28 ℃培養(yǎng)4 d后，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.6 不同培養(yǎng)濃度的綠色木霉發(fā)酵液抑制黃曲霉產(chǎn)毒效果的影響將綠色木霉菌株接種到新鮮的PD液體培養(yǎng)基中，每個(gè)250 mL三角瓶中裝有50 mL培養(yǎng)基，接種量為4×104mL-1孢子培養(yǎng)基，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，4 ℃，10 000 g 離心15 min，取上清液，再用無(wú)菌過(guò)濾器抽濾滅菌，真空冷凍濃縮100倍后，將其與無(wú)菌水配成終濃度為0.5 %，10 %，30 %，50 %和80 %的懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述不同濃度的懸液和pH7.0，50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(PBS)各5 mL，分別與20 mL黃曲霉(1 d液體培養(yǎng)物)混合，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，參照ELISA-Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取毒素進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)檢測(cè)黃曲霉毒素殘余量，分析不同培養(yǎng)濃度發(fā)酵液抑制黃曲霉產(chǎn)毒的效果。

1.7 綠色木霉發(fā)酵液對(duì)花生收獲前黃曲霉污染的影響花生種子常規(guī)消毒后，盆栽于大田，莢果生長(zhǎng)后期將植株移回溫室大棚，并對(duì)其進(jìn)行干旱脅迫處理以及干旱脅迫和黃曲霉人工接種處理。

(1)黃曲霉孢子溶液的制備：黃曲霉菌株制備成孢子濃度為4×106mL-1的溶液，接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱下黑暗培養(yǎng)2周。

(2)黃曲霉侵染載體的制備：將上述培養(yǎng)的黃曲霉人工接種在玉米顆粒上，加入適當(dāng)水分，28 ℃暗培養(yǎng)，直到玉米顆粒完全被黃曲霉侵染，以此作為花生的侵染材料。

(3)將黃曲霉孢子接種于花生的種植土壤中，孢子接種量為6×1010個(gè)·株，并干旱處理2周后，分別將不同濃度的發(fā)酵液噴灑于已接種黃曲霉的花生種植土壤中，每株花生噴灑100 mL，隔5 d 噴灑1次，對(duì)照組則噴灑相同體積的無(wú)菌水，每個(gè)處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理2周后，將花生收獲、曬干，檢測(cè)AFB1含量；同時(shí)采取土樣，檢測(cè)土壤中黃曲霉種群數(shù)。

1.8 薄層層析法定性測(cè)定綠色木霉發(fā)酵液對(duì)AFB1的降解效果取上述濃度為5%的發(fā)酵懸液、等體積pH7.0，50 mmol·L-1PBS緩沖液與1 mL濃度為60 ng·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品混合，28 ℃恒溫箱中放置5 h后，加入等體積氯仿抽提毒素，真空干燥后，加入1 mL甲醇水(1∶1)溶解抽提物。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的抽提物各取1 μL點(diǎn)在薄層層析板上，以丙酮-三氯甲烷(8+92)作為擴(kuò)展劑，展開(kāi)10～12 cm，取出，在紫外燈下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 平皿拮抗作用-兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法PDA平板在28 ℃恒溫下靜置培養(yǎng)8 d，每天觀察記錄的結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，綠色木霉對(duì)黃曲霉的拮抗作用很強(qiáng)，對(duì)峙培養(yǎng)第3 天即可見(jiàn)拮抗效果，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，拮抗活性越強(qiáng)，綠色木霉向黃曲霉擴(kuò)張逐漸形成包圍趨勢(shì)，測(cè)量拮抗帶寬度為5.5 mm。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間的綠色木霉發(fā)酵液對(duì)抑制黃曲霉活性的影響取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液，測(cè)定其對(duì)黃曲霉的抑菌活性，規(guī)定抑菌活性最強(qiáng)的相對(duì)抑制率為1。結(jié)果(圖2)表明，綠色木霉發(fā)酵液抑菌活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，培養(yǎng)至第7天達(dá)到最強(qiáng)，以后抑菌活性幾乎沒(méi)有變化。

2.3 不同培養(yǎng)濃度的綠色木霉發(fā)酵液對(duì)抑制黃曲霉產(chǎn)毒效果的影響取培養(yǎng)時(shí)間為7 d的發(fā)酵液，用無(wú)菌水配制成0.5 %，1 %，3 %，5 %和8 %共5個(gè)不同濃度的懸液，分別取上述不同濃度的懸液及pH7.0，

50 mmol·L-1PBS緩沖液各5 mL，分別與20 mL黃曲霉(1 d液體培養(yǎng)物)混合，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，用ELISA-Kit試劑盒測(cè)定毒素殘余量。結(jié)果(圖3)表明，與對(duì)照組相比，隨著發(fā)酵液濃度的升高，毒素殘余量降低，直至發(fā)酵液濃度為5 %時(shí)，毒素殘量達(dá)到最低值，此后，隨發(fā)酵液濃度升高，毒素殘量基本沒(méi)變化。結(jié)果表明，綠色木霉發(fā)酵液具有抑制黃曲霉產(chǎn)毒的效果，可能是通過(guò)抑制黃曲霉生長(zhǎng)，導(dǎo)致黃曲霉毒素產(chǎn)出減少。

2.4 不同濃度綠色木霉發(fā)酵液對(duì)花生收獲前黃曲霉污染的影響將黃曲霉孢子接種于花生種植土壤中，孢子接種量為6×1010個(gè)·株，干旱處理2周后，將不同濃度的發(fā)酵液分別噴灑于已接種黃曲霉的花生種植土壤中，每株花生噴灑100 mL，隔5 d噴灑1次，對(duì)照組則噴灑相同體積的無(wú)菌水，每個(gè)處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理2周后，將花生收獲，曬干，檢測(cè)AFB1含量；同時(shí)采取土樣，檢測(cè)土壤中黃曲霉種群數(shù)。結(jié)果(圖4，5)表明，該發(fā)酵液能有效降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，降低率達(dá)97%，同時(shí)能較大程度地抑制土壤中黃曲霉菌的生長(zhǎng)，且發(fā)酵液濃度越高，抑制效果越佳。

2.5 薄層層析法定性測(cè)定發(fā)酵液對(duì)AFB1的降解效果薄層層析定性檢測(cè)發(fā)酵液對(duì)AFB1的降解作用，結(jié)果(圖6)表明，發(fā)酵液對(duì)AFB1的降解作用明顯，與對(duì)照組相比，毒素殘余量明顯降低，說(shuō)明發(fā)酵液能有效降解AFB1。

3 討 論

3.1 木霉菌生防作用綠色木霉是木霉菌中具有重要經(jīng)濟(jì)意義的一種，對(duì)植物致病真菌具有拮抗作用，據(jù)報(bào)道，木霉可抑制約29種植物病源真菌，其中研究最多的是灰霉菌、腐霉菌、絲核菌、炭疽菌和鐮刀菌[14-15]。國(guó)內(nèi)近幾年利用木霉在許多病害上做了大量試驗(yàn)，防治效果明顯[16]。黃曲霉真菌廣泛存在于土壤中，其孢子可擴(kuò)散至空氣中傳播，化學(xué)防治難度較大。本試驗(yàn)研究表明，綠色木霉菌株對(duì)黃曲霉具有明顯的拮抗作用，說(shuō)明該菌是一種較強(qiáng)的廣譜性拮抗真菌，因而在花生黃曲霉病的生物防治中具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

3.2 木霉抗菌機(jī)理木霉菌是一種資源豐富的拮抗微生物，在植病生防中具有重要的、不可忽視的作用。其抗菌機(jī)制包括產(chǎn)生抗生素、重寄生作用、溶菌作用以及競(jìng)爭(zhēng)作用(主要為對(duì)生存空間和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng))。本研究結(jié)果表明，在平皿對(duì)峙培養(yǎng)中，綠色木霉菌可以抑制花生黃曲霉菌落的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為：(1)產(chǎn)生抑菌帶；(2)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用，即覆蓋或深入花生黃曲霉菌落中生長(zhǎng)，占領(lǐng)大部分營(yíng)養(yǎng)空間。

在抗生作用中，木霉可以產(chǎn)生拮抗性化學(xué)物質(zhì)來(lái)毒害植物病原真菌，這些物質(zhì)包括抗生素和一些酶類(lèi)。Brukner 等[17]從綠色木霉分離提純了1組特殊的抗菌肽，分別為trichobrachin 和trichovirin。Sonia 等[18]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉能產(chǎn)生可揮發(fā)性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過(guò)這種物質(zhì)影響其他真菌的蛋白質(zhì)合成和生長(zhǎng)速度的方式，從而起到抑菌作用。本研究結(jié)果表明，綠色木霉發(fā)酵液中可能含有抗菌活性物質(zhì)，能顯著抑制黃曲霉，導(dǎo)致產(chǎn)毒能力降低。大田試驗(yàn)結(jié)果表明，該發(fā)酵液能顯著降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，降低率達(dá)97%，同時(shí)能較大程度地抑制土壤中黃曲霉的生長(zhǎng)，這與Brukner 等[17]、Sonia 等[18]的結(jié)果相一致。

3.3 生防制劑AFT的生物脫毒主要采用微生物和微生物產(chǎn)生的酶來(lái)進(jìn)行，多種微生物，包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌、霉菌和藻類(lèi)都能或多或少降解AFT，AFT解毒酶是目前降解效果較好的一類(lèi)酶[19]，但該酶的產(chǎn)量較低，限制了其在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用。綠色木霉發(fā)酵液能顯著抑制AFB1的產(chǎn)生，抑制率達(dá)95%，因此，綠色木霉發(fā)酵液具有大田生產(chǎn)中防治花生AFT污染的潛力，抑制效果優(yōu)勝于同類(lèi)生防制劑。

3.4 薄層層析法與ELISA薄層層析法、酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定黃曲霉毒素殘余量是食品中最常用的鑒定方法，薄層層析法具有直觀、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，而酶聯(lián)免疫法則具有快速、精確等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)將2種方法結(jié)合起來(lái)檢測(cè)黃曲霉毒素B1的殘余量，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性。

研究結(jié)果表明，生防真菌綠色木霉對(duì)花生黃曲霉具有拮抗作用，其發(fā)酵液能夠抑制黃曲霉生長(zhǎng)及降解黃曲霉毒素，并且能降解AFT污染。該發(fā)酵液中可能含有抗菌活性物質(zhì)，可進(jìn)一步研究其抗菌機(jī)制，為在大田生產(chǎn)中防治花生AFT的污染提供理論依據(jù)。