茶皂素對(duì)沙門氏菌的抑菌機(jī)理及對(duì)雞胸肉的保鮮效果

何榮榮，譚運(yùn)壽，張美虹，李正香，鐘秋平

(1海南大學(xué) 食品學(xué)院，?？?570228；2海南侯臣生物科技有限公司，海南 澄邁 571921)

茶皂素(Tea Saponin)是油茶籽榨油后的副產(chǎn)物茶枯餅中提取出來的一類糖苷化合物，它是茶枯餅中主要活性成分之一，具有良好的抗氧化和抑菌活性[1-3]。近年來，由食源性致病菌引起的疾病威脅著整個(gè)公共安全[4]，沙門氏菌是一類重要的食源性致病菌， 能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)敗血癥、腸胃炎和傷寒等疾病， 嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致患者死亡[5]。畜禽產(chǎn)品是沙門氏菌的主要載體，如肉雞，給消費(fèi)者健康帶來巨大的威脅[6]。天然防腐劑憑借其安全性高、抗菌作用強(qiáng)、抑菌譜廣、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)成為人們研究的焦點(diǎn)[7-8]。目前，關(guān)于茶皂素抑菌研究主要集中在抑菌效果上[9]，對(duì)其抑菌機(jī)理及其在畜禽肉中的保鮮應(yīng)用的報(bào)道較少，因此，筆者以本實(shí)驗(yàn)室提取的茶皂素為實(shí)驗(yàn)原料，通過對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)、形態(tài)、胞外蛋白、堿性磷酸酶及K+泄漏等指標(biāo)研究茶皂素的抑菌機(jī)理，并將其應(yīng)用于雞胸肉保鮮，旨在為開發(fā)天然抗菌劑提供理論指導(dǎo)，也為茶皂素高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑茶皂素(純度85.4%)從海南油茶的茶枯餅中提取；新鮮雞胸肉購(gòu)自海口某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。供試菌：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissp.)、沙門氏菌(Salmonellasp.)、單核細(xì)胞性李斯特菌(Listeriamonocytogenessp.)、大腸桿菌(Escherichiacolisp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureussp.)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosasp.)和熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescenssp.)由海南大學(xué)食品學(xué)院提供。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋公司。無水乙醇、氯化鈉和磷酸(分析純)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；牛血清蛋白和無菌磷酸鹽緩沖液(PBS) 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備無菌超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋購(gòu)自致微(廈門)儀器有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱購(gòu)自寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TAS-990 Super AFG原子吸收光譜儀和T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；S-3000掃描式電子顯微鏡購(gòu)自日本日立公司。

1.3 茶皂素最小抑菌濃度測(cè)定

1.3.1 菌種的活化將供試菌在營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基中傳代活化后4 ℃保存?zhèn)溆?，采用麥?zhǔn)媳葷岱╗10]，將各種供試菌置于適宜溫度(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為37 ℃，熒光假單胞菌為30 ℃，下同)培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，用接種環(huán)挑取供試菌置于無菌生理鹽水(0.9% NaCl)中制成含菌量約為(106～107) cfu·mL-1的菌懸液備用。

1.3.2 茶皂素對(duì)菌株的最小抑菌濃度的測(cè)定采用肉湯稀釋法[11]，用無菌水溶解純化后的茶皂素，采用二倍梯度法將其稀釋成12.5，25.0，50.0，100.0和200.0 g·L-1的抑制液，向滅菌后的平板中加入配制好的上述抑制液2 mL，再加入18 mL冷卻至50 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，將二者混合，使其終濃度分別為1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 g·L-1。待培養(yǎng)基凝固后取100 μL的供試菌懸液于平板上均勻涂布。以無菌水作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察，以肉眼看不見細(xì)菌生長(zhǎng)的最小稀釋濃度作為茶皂素對(duì)供試菌作用的最小抑菌濃度(MIC)。

1.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]的方法，用無菌生理鹽水稀釋供試菌 (106～107) cfu·mL-1，將稀釋后的菌懸液以1%(v/v)的比例接種于液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，150 r·min-1的搖床中培養(yǎng)24 h，加入茶皂素溶液使其最終濃度為MIC，以無菌水作空白，每隔2 h取樣5 mL，分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下吸光值，繪制茶皂素對(duì)供試菌抑制作用的生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)菌蛋白泄漏曲線的測(cè)定參考LV F等[13]的方法，將活化后的供試菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入MIC濃度的茶皂素溶液，以無菌水作空白對(duì)照，加入抑菌物質(zhì)后置于37 ℃，150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在0，2，4，6，8，10，12 h取樣，每次取樣5 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行。將菌懸液在4 000 r·min-1離心10 min。離心后取上清液，加入配置好的考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻靜置5 min在595 nm下測(cè)量其吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制茶皂素對(duì)供試菌蛋白泄漏曲線。

1.6 堿性磷酸酶含量的測(cè)定將活化后的供試菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入茶皂素溶液使其最終濃度為MIC，以無菌水代替茶皂素溶液作空白對(duì)照，加入抑菌物質(zhì)后置于37 ℃，150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在0，4，8，12 h取樣，6 500 r·min-1離心 10 min，取上清液作為樣液，操作按照試劑盒步驟進(jìn)行，于 520 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度值，定義每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位。

1.7 細(xì)胞形態(tài)觀察參考DIAO W R等人[14]的方法，將活化后的供試菌在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入茶皂素溶液至最終濃度為MIC，并以無菌水作為對(duì)照，加入抑菌物質(zhì)后置于37 ℃,150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在4,12 h時(shí)取樣，8 000 r·min-1離心10 min后棄去上清液，收集菌體。0.1 mol·L-1PBS洗滌3次后，再依次用20 %，40 %，60 %，80 %乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)濃度重復(fù)2次，最后用無水乙醇洗脫3次。棄去上清液后將樣品在-20 ℃條件下預(yù)凍1夜，再置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥12 h。取出凍干的樣品，密封防止吸潮，上樣，通過陰極噴涂將樣品金覆蓋，在掃描電子顯微鏡上觀察供試菌的細(xì)胞形態(tài)。

1.8 K+濃度測(cè)定參考MIAO等[15]的方法，將活化后的供試菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，離心參數(shù)為4 000 r·min-1，15min。菌體經(jīng)無菌生理鹽水(0.9% NaCl，用超純水配置)洗滌3次后，重懸于等量生理鹽水中，加入茶皂素溶液，使其最終濃度為MIC，同時(shí)以無菌水+菌、茶皂素水溶液分別作為對(duì)照，置于37 ℃，150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在0，2 h后取樣離心，離心參數(shù)為4 000 r·min-1，15 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜，用原子吸收光譜法測(cè)定液體中K+濃度。

1.9 茶皂素在雞胸肉保鮮中的應(yīng)用

1.9.1 雞胸肉的前處理菌種活化：將冷藏的供試菌(沙門氏菌)取出平板劃線法活化后，使用無菌生理鹽水將供試菌稀釋成 (106～107) mL-1后制成菌懸液，備用。樣品前處理及接種：將宰殺后的肉雞立刻低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無菌條件下剝離出雞胸肉，表面棄去，保留無菌的內(nèi)部樣品，分割成小塊，每塊10 g備用。根據(jù)國(guó)標(biāo)(GB/T4789.4-2008及GB/T 4789.30-2008)對(duì)沙門氏菌的原始污染情況進(jìn)行檢測(cè)，余下的試驗(yàn)樣品進(jìn)行接種，參考Elenadel R等[16]的方法：取40 μL上述新鮮菌液，使用點(diǎn)接種法將菌懸液接種于樣品中，放置1 h，確保菌懸液充分粘附于雞肉樣品中。將樣品置于配置的茶皂素水溶液中浸泡10 min，以無菌水作空白對(duì)照，取出瀝干30 min，保存于無菌密封袋中，置于4 ℃冰箱中保存，分別在0，2，4，6，8，10 d取樣測(cè)各種指標(biāo)。

1.9.2 沙門氏菌菌落數(shù)測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB4789.2-2016，將分割好的小塊雞胸肉(每小塊10 g)從冰箱中取出，粉碎，加入20 mL無菌生理鹽水浸泡30 min后，過濾，取100 μL涂布，將平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察，計(jì)數(shù)。

1.9.3 pH值測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB 5009.237-2016，取分割好的雞胸肉(每塊10 g)粉碎，加入50 mL無菌水，靜置 30 min，過濾取上清液，用 pH 計(jì)測(cè)定樣品的 pH 值，每組重復(fù)3次。

1.9.4 持水率測(cè)定參考Sánchez-González I等[17]的方法，將雞胸肉切成5 mm左右的薄片，準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量，記為G1，然后裝入3層濾紙中，包好密封于50 mL離心管中，4 ℃,6 500 r·min-1離心15 min，取出后立即稱質(zhì)量，記質(zhì)量為G2。持水率=G2/G1×100%。

1.10 數(shù)據(jù)處理采用DPS的單因素方差分析進(jìn)行差異性分析(P<0.05)，使用Origin2017進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對(duì)菌體的最小抑菌(MIC)由表1可以看出，當(dāng)茶皂素達(dá)到一定濃度時(shí)，對(duì)1.1所述幾種供試菌，包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有一定程度的抑制作用，說明茶皂素具有廣譜抑菌效果。同一濃度茶皂素對(duì)不同供試菌的抑菌效果有所差異，其中對(duì)熒光假單胞菌的抑制效果不明顯，濃度達(dá)到20 g·L-1時(shí)，仍有少量菌落形成。對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑制效果最好，MIC均為10 g·L-1。茶皂素對(duì)上述供試菌的抑菌作用從強(qiáng)到弱依次為：沙門氏菌、枯草芽孢桿菌>李斯特菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌>熒光假單胞菌。

表1 不同濃度茶皂素對(duì)7種致病菌的抑制效果比較

注：- 無菌落；+ 少量菌落；++ 較多菌落；+++ 大量菌落

Note: - no colony; + few colonies; ++ a few colonies; +++ numerous colonies

2.2 茶皂素對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)的影響當(dāng)微生物的數(shù)量和培養(yǎng)環(huán)境改變時(shí)，菌液濃度與其吸光值成正比，由吸光值與時(shí)間的變化圖，可得出該微生物的生長(zhǎng)狀況[18]，由圖1可知，對(duì)照組的沙門氏菌符合典型的“S”型生長(zhǎng)曲線，延滯期為4 h，之后快速生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期，12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，即未處理組供試菌能正常生長(zhǎng)。但對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，加入MIC濃度的茶皂素后，沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線發(fā)生了明顯的變化，24 h內(nèi)吸光值均為0，沒有進(jìn)行正常的生長(zhǎng)繁殖，說明茶皂素的加入干擾了供試菌的增殖，導(dǎo)致其生長(zhǎng)異常，從而發(fā)揮抑菌作用。

2.3 茶皂素對(duì)沙門氏菌蛋白質(zhì)泄漏的影響蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，在微生物的代謝活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由圖2可知，與對(duì)照組相比，茶皂素處理后，培養(yǎng)液中蛋白濃度在2 h之內(nèi)快速上升，之后上升速度較緩慢，10 h之后有所下降。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大，只有當(dāng)細(xì)胞膜完整性遭到破壞時(shí)，蛋白質(zhì)才會(huì)大量泄漏至胞外導(dǎo)致胞外蛋白含量上升[19]，此結(jié)果表明茶皂素能夠破壞菌體細(xì)胞膜的完整性，從而發(fā)揮其抑菌功能。

2.4 茶皂素對(duì)沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響由圖3可知，對(duì)照組C1，D1組菌體細(xì)胞外觀光滑，呈桿狀，菌體結(jié)構(gòu)飽滿，完整，沒有出現(xiàn)褶皺、凹陷、變形的現(xiàn)象。由C2可知，經(jīng)茶皂素處理4 h后，供試菌部分細(xì)胞都出現(xiàn)聚集、粘連成團(tuán)的現(xiàn)象。由D2可知，作用12 h后，供試菌菌體外觀發(fā)生明顯的變化，幾乎所有細(xì)胞都出現(xiàn)塌陷、溶洞、表面輪廓不完整的現(xiàn)象，部分細(xì)胞出現(xiàn)折斷現(xiàn)象，細(xì)胞聚集、粘附成團(tuán)，幾乎辨認(rèn)不出正常細(xì)胞形態(tài)。說明茶皂素可以對(duì)沙門氏菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成破壞和損傷，改變菌體正常的形態(tài)，從而導(dǎo)致菌體死亡。

圖3 茶皂素對(duì)沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響C1，C2，D1，D2分別為4 h對(duì)照、4 h MIC、12 h對(duì)照和12 h MICFig.3 Cell morphology of Salmonella sp.C1, C2, D1 and D2 are 4 h control, 4 h MIC, 12 h control and 12 h MIC, respectively

2.5 茶皂素對(duì)沙門氏菌堿性磷酸酶的影響堿性磷酸酶位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間，正常情況下，在胞外是不能檢測(cè)到其活性的，只有在細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜遭到破壞的情況下，才會(huì)泄漏到胞外[20]，由圖4可知，與對(duì)照組相比，供試菌經(jīng)茶皂素作用后，胞外堿性磷酸酶的含量均明顯上升，表明茶皂素可以通過損傷供試菌的細(xì)胞壁、改變細(xì)胞壁的透性、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性來實(shí)現(xiàn)其抑菌作用。

2.6 茶皂素對(duì)沙門氏菌K+釋放的影響當(dāng)微生物曝露于抗生素或者其他不適宜的生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，可能會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)如K+泄漏，因此可以通過測(cè)定K+釋放來研究微生物細(xì)胞的活性[21]。從圖5可以看出，經(jīng)茶皂素處理2 h后供試菌胞外K+濃度均顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步說明茶皂素可以損壞供試菌細(xì)胞膜的完整性，破壞菌體細(xì)胞膜的阻隔性，從而發(fā)揮抑菌作用。

2.7 茶皂素對(duì)雞胸肉沙門氏菌菌落總數(shù)的影響菌落總數(shù)的多少可以反映食品被污染的程度，可以用來觀測(cè)食品中細(xì)菌的繁殖動(dòng)態(tài)，可以作為預(yù)測(cè)貨架期的依據(jù)。由圖6可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組的沙門氏菌菌落均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，初始的菌落總數(shù)分別為1.4 log(cfu·g-1)和1.3 log(cfu·g-1)，對(duì)照組在(0～6 )d內(nèi)，菌落總數(shù)增長(zhǎng)快速，之后緩慢增長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，經(jīng)茶皂素處理之后的雞胸肉在前4 d，菌落總數(shù)上升緩慢，之后上升速度加快，說明茶皂素可以在短時(shí)間內(nèi)較好的抑制雞胸肉中沙門氏菌的生長(zhǎng)繁殖，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，茶皂素的抑菌效果逐漸減弱。

2.8 茶皂素對(duì)雞胸肉pH的影響pH值可以用來衡量食品的新鮮程度，如果食品腐敗變質(zhì)加劇，pH就會(huì)有升高的趨勢(shì)[22]。由圖7可知，對(duì)照組和處理組的pH值均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，起始pH分別為5.95和6.07，儲(chǔ)藏第2天的pH明顯下降，下降的原因可能是與體內(nèi)代謝活動(dòng)有關(guān)，比如糖酵解途徑產(chǎn)生的乳酸，磷酸肌酸和ATP分解產(chǎn)生的磷酸，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的小分子氨基酸等都會(huì)導(dǎo)致pH下降。2 d后pH呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，可能的原因是微生物的存在會(huì)分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)如TVB-N和TMA等引起pH值上升。與對(duì)照組相比，經(jīng)茶皂素處理后雞胸肉的pH變化緩慢，間接說明茶皂素可以抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖從而達(dá)到保鮮的效果。

2.9 茶皂素對(duì)雞胸肉持水率的影響持水性作為可以反映食品凝膠結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，持水性越高說明食品中凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，保持水分的能力越強(qiáng)[23-24]，由圖8可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組持水率均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這是由于微生物的存在導(dǎo)致了雞胸肉中蛋白質(zhì)的分解，破壞了肉制品內(nèi)部的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而引起持水率下降。MIC組持水率較對(duì)照組而言，下降緩慢，儲(chǔ)藏期結(jié)束仍高于對(duì)照組，說明茶皂素的存在抑制了微生物的生長(zhǎng)，延緩了蛋白組被分解的速率，減緩了持水率下降的速度，對(duì)雞胸肉的保鮮產(chǎn)生了積極的作用。

3 討 論

本研究利用最小抑菌濃度對(duì)比了茶皂素對(duì)幾種常見致病菌的抑菌效果，并且根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白泄漏濃度、細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶及K+濃度等指標(biāo)，從細(xì)胞水平上研究了茶皂素的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，茶皂素能夠阻止菌體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)，其對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度均為10 g·L-1，經(jīng)過茶皂素處理后，沙門氏菌菌體外觀輪廓遭到破壞，粘連成團(tuán)，并且出現(xiàn)塌陷、溶洞等現(xiàn)象，失去原有形狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁均有破壞作用，損壞了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，改變了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的透性，導(dǎo)致其阻隔性下降，胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子、維持電解質(zhì)平衡的K+、間隙酶堿性磷酸酶等泄漏到細(xì)胞外，干擾了菌體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致了代謝活動(dòng)的異常，從而引起了細(xì)胞的死亡。本研究結(jié)果與張赟彬等[25]研究荷葉精油對(duì)肉類食品中常見致病菌的抑菌機(jī)理結(jié)果相似，將其應(yīng)用于雞胸肉保鮮中發(fā)現(xiàn)，茶皂素可以較好地抑菌沙門氏菌的生長(zhǎng)繁殖，減緩pH值上升的速度，有效改善肉制品的持水性，從而達(dá)到改善肉制品品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期的目的?？赡艿脑蚴遣柙硭匾种屏穗u胸肉中微生物的生長(zhǎng)繁殖。

茶皂素作為一種天然的活性物質(zhì)，其在天然防腐劑的開發(fā)等方面具有較好的價(jià)值，但本研究對(duì)茶皂素的抑菌機(jī)理還不夠深入，今后有待從代謝組學(xué)、基因組學(xué)等方面更加深入研究茶皂素的抑菌機(jī)理，以期為天然抑菌劑的開發(fā)提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。