黃芪堿溶多糖的提取及抗氧化活性研究

謝丹丹 鄭丹 張麗霞

摘? ? 要：為優(yōu)化黃芪堿溶多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性，本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化黃芪堿溶多糖的提取工藝，并通過Smirnoff法及鄰苯三酚自氧化法研究其體外清除自由基能力。黃芪堿溶多糖最優(yōu)提取工藝條件為提取溫度70 ℃、提取時間130 min、料液比1∶20，此條件下提取率為（15.63±0.36）%。為研究黃芪堿溶多糖的抗氧化活性，進行了體外羥基自由基和超氧陰離子自由基清除試驗，黃芪堿溶多糖隨濃度（0.2～1.2 mg·mL-1）升高，對羥基自由基的清除率先升后降，當(dāng)濃度為0.8 mg·mL-1時清除率最高為（65.38±0.75）%，顯著高于同濃度的Vc處理（P<0.05），亦高于最高清除率的Vc處理（1.0 mg·mL-1）;在低濃度下（0.5，1.0 mg·mL-1）堿溶多糖對超氧陰離子的清除率較高，分別為（49.26±0.06）%和（57.55±0.05）%，顯著高于同濃度Vc處理（P<0.05）。由此可見，本文優(yōu)化工藝大大提高了黃芪多糖的提取率，且提取的堿溶多糖具有較好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：黃芪;堿溶多糖;堿提法;抗氧化活性

中圖分類號：R282; O629.12? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.005

Abstract： In order to optimize the extraction process and antioxidant activity of Astragalus alkaloid soluble polysaccharide， the extraction process of Astragalus alkaloid soluble polysaccharide was optimized by orthogonal test on the basis of single factor test， and its scavenging ability to free radicals in vitro was studied by Smirnoff method and pyrogallol auxidation method. The optimum extraction conditions were as follows： extraction temperature 70 ℃， extraction time 130 min， liquid ratio 1∶20， and the extraction rate of alkali-soluble polysaccharide was （15.63±0.36）%. In order to study the antioxidant activity of Astragalus alkaloid soluble polysaccharide， the scavenging experiments of hydroxyl radical and superoxide anion radical in vitro were carried out. With the increase of concentration （0.2～1.2 mg·mL-1）， the scavenging rate of hydroxyl radical increased at first and then decreased. When the concentration was 0.8 mg·mL-1， the scavenging rate of hydroxyl radical was the highest[（65.38±0.75）%]， which was significantly higher than that of Vc（P<0.05）， and also higher than the highest scavenging rate of Vc treatment（1.0 mg·mL-1）. At low concentration（0.5 mg·mL-1， 1.0 mg·mL-1）， the scavenging rate of superoxide anion by alkali-soluble polysaccharide was（49.26±0.06）% and（57.55±0.05）%， respectively， which was significantly higher than that of Vc（P<0.05）. Comprehensicely，? the extraction rate of the polysaccharide was greatly improved under the optimal condition of this experiment， and the extracted alkali-soluble polysaccharide had better anti-oxidation activity.

Key words： Astragalus membranaceus; alkali-soluble polysaccharide; alkali extraction; antioxidant activity

黃芪（Astragalus membranaceus），又名綿芪，為豆科（Leguminosae）黃芪屬（Astragalus）多年生草本植物，主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅、黑龍江和山西等地[1]。黃芪多糖是黃芪藥用部分的主要活性物質(zhì)之一，可作為免疫促進劑或調(diào)節(jié)劑，同時具有抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤及提高免疫力等多重功效[2-5]。目前有關(guān)堿溶多糖的研究已在甜菜粕、茯苓、金針菇等植物中有較多的研究[6-8]，傳統(tǒng)的溶劑法雖在工業(yè)上是較常用的提取方法，且操作方便，但其存在提取時間長、溫度高、會導(dǎo)致活性組分失活、提取率低等缺點。本試驗采用堿提法提取黃芪堿溶多糖并優(yōu)化提取工藝條件，同時對提取的堿溶多糖進行體外抗氧化活性研究，旨在進一步提高黃芪多糖的提取率，為黃芪藥理學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

黃芪購于黑龍江省大慶市讓胡路區(qū)普濟康復(fù)醫(yī)院藥房。

黃芪烘干→粉碎→過80目篩（直徑0.180 mm）→粉末→真空干燥器備用。

1.2 主要試劑

無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、碳酸鈉、濃氨水、過氧化氫、丙酮、溴化鉀、硫酸亞鐵、氫氧化鉀、水楊酸、三（羥甲基）氨基甲烷、鄰苯三酚，所有試劑均為市售分析純。

1.3 試驗儀器

試驗所需儀器如表1所示。

1.4 試驗方法

1.4.1 堿溶多糖提取流程? ? 黃芪粉末→優(yōu)化1%氫氧化鉀溶液提取的條件（提取溫度、提取時間、料液比）→離心（3 600 r·min-1，15 min）→合并上清液→100 ℃水浴濃縮至原體積1/3→硫酸中和→透析→水浴濃縮→3倍體積95%乙醇醇沉過夜→無水乙醇、丙酮離心洗滌（3 600 r·min-1，15 min）→干燥器干燥→堿溶粗多糖→冷凍保存。

1.4.2 堿溶多糖紅外光譜檢測? ? 分析天平稱取黃芪堿溶多糖2.0 mg，加入溴化鉀壓片后經(jīng)傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

1.4.3 堿溶多糖含量測定方法? ? 采用苯酚硫酸法[9]，用分光光度計在490 nm波長處測定其吸光度，用回歸方程計算出堿溶多糖含量，并計算其堿溶多糖得率。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱量干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖于容量瓶中，定容。分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成一定濃度梯度于干燥試管中，補加蒸餾水至相同體積，蒸餾水為空白，分別加6%苯酚0.5 mL，濃H2SO4 2.5 mL，立即搖勻，室溫靜置10 min后于490 nm測定光吸收值，每個濃度平行做3次，繪制葡萄糖濃度與吸收值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）多糖含量測定。以堿溶多糖取代葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進行（1）試驗，測定490 nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量，進一步獲得多糖得率，其計算公式為：多糖得率（%）=多糖含量/原料質(zhì)量×100

1.4.4 堿溶多糖提取工藝條件優(yōu)化[10]? ? ?（1）堿溶多糖提取單因素試驗。以1%氫氧化鉀為溶劑，在其他條件相同的情況下，分別研究提取溫度、提取時間、料液比3個因素對黃芪多糖提取率的影響。各因素梯度設(shè)置詳見表2。

（2）多糖提取的正交試驗。在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，按L934設(shè)計正交表進行三因素三水平的正交試驗，得出最佳提取條件。

1.4.5 黃芪堿溶多糖抗氧化活性研究? ? （1）羥基自由基（·OH）清除試驗-Smirnoff法[11-12]。取25支具塞試管，且每支試管中都加入1 mL 9 mmol·L-1的FeSO4溶液，2 mL 9 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液，每支試管分別加入不同質(zhì)量濃度的黃芪堿溶多糖溶液2 mL，最后加入8.8 mol·L-1 H2O2 2 mL，在37 ℃下反應(yīng)30 min。以蒸餾水作空白調(diào)零，在波長510 nm處測吸光值。每個濃度平行做3次，以Vc作對照，計算自由基的清除率，自由基的清除率的計算公式為：

·OH清除率（%）=（ΔA0-ΔAx）/ΔA0×100

式中，A0為空白對照液的吸光度;Ax為加入多糖液的吸光度。

（2）超氧陰離子自由基（·O2-）清除試驗-鄰苯三酚自氧化法[11-12]。25 ℃水浴中預(yù)熱的0.05 mol·L-1 Tris-HCl（pH值為8.2）。依次加入不同濃度1 mL的黃芪堿溶多糖溶液和4.0 mL 25 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，并立刻于波長325 nm處測吸光值，每個濃度平行做3次，以Vc作為對照，計算超氧陰離子清除率。超氧陰離子清除率的計算公式為：

·O2-清除率（%）=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100

式中，A0為空白組，即鄰苯三酚的自氧化速率;A為加入多糖溶液后鄰苯三酚的氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿溶多糖傅立葉紅外光譜檢測結(jié)果

由圖1可知，在3 438.24 cm-1和3 425.00 cm-1處有締合的-OH伸縮振動吸收峰，具有典型的-OH吸收峰[13];在1 900 cm-1～1 600 cm-1，具有羰基吸收峰，證明是多糖。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過苯酚硫酸法測定，以葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光值（A）為縱坐標(biāo)，繪出葡萄糖C與A值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線方程A=1.2×10-2C-0.90×10-2（R2=0.999 8），如圖2所示。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 提取溫度? ? 在提取時間為90 min、料液比為1∶15的條件下，研究提取溫度對黃芪堿溶多糖提取率的影響。由圖3可知，在50～90 ℃，隨溫度的升高，提取率呈先升后降的趨勢，在60 ℃達(dá)到峰值，提取率為7.7%，與其他溫度處理差異顯著（P<0.05）。因此，黃芪堿溶多糖的提取溫度選擇60 ℃較為適宜。

2.3.2 提取時間? ? 在提取溫度為60 ℃、料液比為1∶15的條件下，研究提取時間對黃芪堿溶多糖提取率的影響。由圖4可知，在50～130 min，多糖的提取率隨提取時間的增加呈先升后降趨勢，堿溶多糖提取率在110 min達(dá)到峰值，為6.9%，與其他提取時間處理差異顯著（P<0.05）。因此，提取時間選擇110 min較為適宜。

2.3.3 料液比? ? 在提取溫度為60 ℃、提取時間為110 min的條件下，研究料液比對黃芪堿溶多糖提取率的影響。由圖5可知，多糖提取率隨料液比的能加呈先升后降趨勢，多糖提取率在提取料液比為1∶15時達(dá)到峰值，為7.9%，與其他料液比處理差異顯著（P<0.05）。因此，料液比選擇1∶15較為適宜。

2.4 正交試驗結(jié)果

通過單因素分析結(jié)果，正交試驗因素水平，見表3。

由圖4可知，各因素對黃芪堿溶多糖提取率的影響程度依次是提取料液比（A）>提取時間（C）>提取溫度（B），最優(yōu)條件為A3B3C3，即提取溫度70 ℃、提取時間130 min、料液比1∶20，此條件與正交試驗中多糖最大提取率對應(yīng)的處理組A3B1C3不同，故在最優(yōu)條件（A3B3C3）下，開展3次驗證試驗，計算黃芪堿溶多糖平均提取率為（15.63±0.36）%。

2.5 堿溶多糖抗氧化活性研究結(jié)果

2.5.1 清除羥自由基（·OH）? ? 如表5所示，黃芪堿溶多糖對·OH的清除率均隨濃度（0.2～1.2 mg·mL-1）的增加呈先升后降的趨勢，在濃度為0.8 mg·mL-1時達(dá)到最大（65.38±0.75）%，顯著高于同濃度的Vc處理（P<0.05），亦高于最高清除率的Vc處理（1.0 mg·mL-1），表明黃芪堿溶多糖清除（·OH）的活性高于Vc。

2.5.2 清除超氧陰離子自由基（·O2-）? ? 如表6所示，黃芪堿溶多糖和Vc對·O2-清除率均隨濃度（0.5～3.0 mg·mL-1）的增加，呈先升后降的趨勢。其中，Vc在濃度為2.0 mg·mL-1時，對·O2-的清除率達(dá)到最大為94.42%，高于堿溶多糖濃度在2.0 mg·mL-1時對·O2-的清除能力;而黃芪堿溶多糖在低濃度（0.5，

1.0 mg·mL-1）下，對·O2-的清除率較高，分別為（49.26±0.06）%和（57.55±0.05）%，顯著高于同濃度Vc處理（P<0.05）。表明黃芪堿溶多糖在低濃度下（0.5，1.0 mg·mL-1）清除·O2-的活性高于Vc。

3 結(jié)論與討論

孫英華等[14]、閻力君等[15]、金芬芬等[16]分別采用不同的提取方法提取黃芪多糖，結(jié)果表明：提取方法不同黃芪多糖提取率不同，但提取率均未超過10%。梁子敬等[1]、李海歐等[17] 分別采用超聲輔助提取法和水回流提取法提取黃芪多糖，結(jié)果表明：黃芪多糖提取率分別為6.18%和6.4%，兩者的提取率均不高，但這兩種方法在提取過程中對黃芪有效成分破壞程度小。李金芳[18]采用水煎煮法確定的最佳提取工藝為：提取時間45 min、提取溫度100 ℃、料液比1∶10、提取次數(shù)3次， 多糖提取率為10.35%。劉永錄等[19]采用NaOH水溶液提取法：取黃芪藥材400 g，分別加12和10倍量pH值為12的NaOH水溶液煎煮2次，經(jīng)后續(xù)處理，黃芪多糖提取率為7.73%。本試驗采用堿提法通過單因素試驗和正交試驗對黃芪堿溶多糖的提取工藝進行優(yōu)化，在提取溫度70 ℃、提取時間130 min、料液比1∶20，堿溶多糖提取率達(dá)（15.63±0.36）%，提高了黃芪的利用率及黃芪多糖的提取率。

李金芳[18]、胡碧君[20]、吳銘等[21]研究結(jié)果表明：黃芪多糖具有抗氧化活性，但均未對黃芪多糖的抗氧化活性進行具體研究。Vc可通過逐級供給電子而轉(zhuǎn)變?yōu)榘朊摎淇箟难岷兔摎淇箟难岬倪^程清除體內(nèi)自由基，是目前試驗研究的標(biāo)準(zhǔn)對照[22]。本試驗中，黃芪堿溶多糖在0.2～1.2 mg·mL-1范圍內(nèi)對羥基自由基的清除率呈先升后降，除1.0 mg·mL-1處的其他濃度黃芪堿溶多糖對羥基自由基的清除率均顯著高于同濃度Vc處理。對·O2-清除率在低濃度（0.5，1.0 mg·mL-1）下顯著高于同濃度Vc處理。因此，黃芪堿溶多糖可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中與清除自由基有關(guān)藥物的有效成分或輔料。

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