新疆NADC30-like PRRSV的分離鑒定及遺傳變異分析

趙潔雅 黃炯 王沅 汪萍 參都哈西 古麗尼尕兒·艾尼 馬文戈 夏俊

摘? ? 要：為了探明研究新疆地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）NADC30-like病毒株XJTK的遺傳變異特征，本試驗(yàn)分離病毒株后對(duì)該病毒的Nsp2和ORF5基因進(jìn)行克隆和測序，其片段大小分別為648 bp和603 bp，其中Nsp2基因存在3處不連續(xù)共393個(gè)核苷酸的缺失，分別缺失333，57和3個(gè)核苷酸，完全符合NADC30-like毒株的基因特征;將病毒株XJTK與已知北美型PRRSV代表株VR2332，高致病性PRRSV國內(nèi)代表株JXA1、TJ，美國分離株NADC30，及NADC30-like國內(nèi)代表株HENAN-HEB、CHsx1401進(jìn)行序列比對(duì)表明，XJTK株Nsp2和ORF5基因核苷酸序列與參考株同源率分別為36.4%～90.3%和83.7%～93.0%，進(jìn)一步遺傳進(jìn)化分析表明，其與PRRSV毒株VR2332、JXA1和TJ株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與美國分離株NADC30及國內(nèi)NADC30-like代表株CHsx1401和HENAN-HEB親緣關(guān)系較近，同屬于NADC30-like亞群，但仍屬于相對(duì)獨(dú)立的分支。本研究是新疆首次證實(shí)豬群中存在NADC30-like PRRSV，可為該地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的防制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒;NADC30-like;遺傳變異分析

中圖分類號(hào)：S828; S432.4+1? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.010

Abstract： In order to find out the genetic variation characteristics of pig reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） NADC30-like isolate XJTK strain in Xinjiang， the Nsp2 and ORF5 gene of the virus was cloned and sequenced with synthetic primers. The results showed that the fragment sizes of Nsp2 and ORF5 were 648 bp and 603 bp respectively， in which the Nsp2 gene had three discontinuous deletions of 393 nucleotides， including 333， 57 and 3 nucleotides respectively， matching with the genetic characteristics of NADC30-like strain. The virus strain XJTK was compared with the known PRRSV representative strain （VR2332， JXA1， TJ， NADC30， HENAN-HEB and CHsx1401） through the sequence alignment and genetic evolution analysis. The results showed that the nucleotide sequence homology rates between Nsp2， ORF5 gene and the reference strain were 36.4%～90.3% and 83.7%～93.0%， respectively. Further genetic and evolutionary analysis showed that XJTK strain was closely related to NADC30， CHsx1401， and HENANHEB， which were belonged to NADC30-like subgroup， but still belonged to a relatively independent branch. This study confirmed the existence of NADC30-like PRRSV in pig populations in Xinjiang， which could provide a reference for the prevention and control of pig reproductive and respiratory syndrome in this area.

Key words： pig reproductive and respiratory syndrome virus; NADC30-like; genetic variation analysis

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的傳染病，可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)和各年齡段豬呼吸障礙等。自20世紀(jì)80年代該病在美國和加拿大出現(xiàn)后，在全球范圍內(nèi)傳播，已成為全球豬病防控上的一大難題[1-2]。疫苗接種作為目前預(yù)防PRRSV感染的主要措施，主要包括滅活疫苗和弱毒活疫苗兩種[3-6]，前者免疫效果較差，而后者安全性較低且可能出現(xiàn)不同程度突變的新毒株感染，綜合導(dǎo)致疫苗的預(yù)防效果并不理想，使豬繁殖與呼吸綜合征的防控日益困難[7]。

PRRSV為動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）的成員，是大小約15 kb的單股正鏈RNA病毒，含有8個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），其中ORFl（ORFla和ORF1b）編碼病毒RNA復(fù)制酶，ORF2～ORF7分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M和N[8-9]。通過對(duì)PRRSV序列進(jìn)行比較，各分離株基因組間變異廣泛，尤以Nsp2和ORF5基因的變異最大[10]。在我國，高志強(qiáng)等[11]在PRRSV分離株BJ-4、HB-1（sh）/2002和HB-2（sh）/2002的全基因測序中，首次發(fā)現(xiàn)Nsp2存在蛋白缺失現(xiàn)象，這3株Nsp2推導(dǎo)的氨基酸序列還存在多位點(diǎn)置換，變異主要發(fā)生在保守氨基酸區(qū)域[12]。2006 年，在國內(nèi)暴發(fā)的PRRSV強(qiáng)毒株（HP-PRRSV）中，發(fā)現(xiàn)Nsp2區(qū)域中B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位中有30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失[13-14]。2008年，蘇貴成[15]通過對(duì)分離得到的PRRSV新疆毒株進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)Nsp2有兩處共29個(gè)氨基酸發(fā)生變異。

2018年底，新疆某豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）疫苗免疫的母豬群突發(fā)大規(guī)模流產(chǎn)，本研究以流產(chǎn)胎兒肺臟為材料，分離PRRSV毒株，采用PCR方法對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，并與已知的PRRSV代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，旨在為新疆地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征流行病學(xué)調(diào)查及防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、抗生素購自Hyclone公司;Marc-145細(xì)胞由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心）提供;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;DNA Marker DL 2 000購自寶生物工程（大連）有限公司;RT-PCR一步法試劑盒購自Promega公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病料采集及處理

PRRSV疑似病料采自新疆某PRRSV疫苗免疫豬場流產(chǎn)胎兒肺臟，共10份。取病料約5.0 g，置于研磨器，加入1.5 mL滅菌生理鹽水，研磨成混濁液。將混濁液轉(zhuǎn)移至2 mL滅菌離心管中，8 000 r·min-1 4 ℃離心5 min，棄沉淀，取上清液-20 ℃凍存。

1.3 病毒分離方法

無菌取上面收集的肺臟病料，加入適量的PBS液，用研磨器研磨為肉糜狀，加入4倍組織培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，高速離心取上清液，微孔過濾除菌，當(dāng)Marc-145細(xì)胞長至70%～80%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μL病料濾液，37 ℃吸附1 h，吸取病料濾液后補(bǔ)加DMEM（培養(yǎng)基）完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）。

1.4 PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因擴(kuò)增及序列分析

樣品核酸提取按照病毒基因組提取試劑盒來操作。25 μL RT-PCR反應(yīng)體系包含10×One Step RNA Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1 dNTP Mixture 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 5 μL，5 U·μL-1 AMV RTase XL 1 μL，5 U·μL-1 AMV-Optimized Taq 1 μL，40 U·μL-1 RNase Inhibitor 0.5 μL，20 μmol·L-1上下游引物（表1）各0.5 μL，核酸模板1 μL，最后加入RNase Free dH2O至終體積25 μL。RT-PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，56.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。1.0%濃度瓊脂糖凝膠電泳約20 min后觀察結(jié)果。RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將獲得的Nsp2和ORF5基因序列用DNA Star分析軟件與所選參考毒株核苷酸序列進(jìn)行同源性比較及遺傳進(jìn)化分析，并繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

將處理過的病料接種于Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)至第4代出現(xiàn)典型的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞聚集成叢，之后固縮、變圓、部分細(xì)胞緊縮呈索狀，最后皺縮、脫落（圖1）;細(xì)胞對(duì)照未見異常（圖2）。

2.2 PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因的RT-PCR擴(kuò)增

本研究從分離到的病毒株中提取基因組后進(jìn)行了PRRSV Nsp2和ORF5基因擴(kuò)增，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小與NADC30-like的Nsp2和ORF5相符，分別為648 和603 bp（圖3）。

2.3 PRRSV XJTK株Nsp2基因測序及比對(duì)

PRRSV病毒主要分為2種基因型：Ⅰ型（歐洲型）和Ⅱ型（美洲型）[3]。將Nsp2基因克隆至T載體后測序，所得序列與北美型PRRSV代表株VR2332，高致病性PRRSV國內(nèi)代表株JXA1、TJ及美國分離株NADC30進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，PRRSV XJTK株與參考毒株VR2332相比，Nsp2基因存在3處不連續(xù)共393個(gè)核苷酸的缺失，分別缺失333，57和3個(gè)核苷酸，這樣的缺失與NADC30株完全相同，即完全符合NADC30-like毒株的基因特征。

2.4 PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因同源性及遺傳進(jìn)化分析

PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因序列與國內(nèi)外代表株（北美型PRRSV代表株VR2332，高致病性PRRSV國內(nèi)代表株JXA1、TJ，美國分離株NADC30，NADC30-like國內(nèi)代表株HENAN-HEB、CHsx1401）進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。同源性分析結(jié)果（圖4、圖5）顯示，XJTK株Nsp2和ORF5基因核苷酸序列與參考株相比同源率分別為36.4%～90.3%及83.7%～93.0%，均表現(xiàn)為與JXAl株的同源性最低，與NADC30株同源性最高。Nsp2和ORF5基因遺傳演化分析結(jié)果（圖6、圖7）顯示，XJTK株屬基因II型，與北美型代表株VR2332及高致病性PRRSV毒株JXA1和TJ親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與美國分離株NADC30及國內(nèi)NADC30-like代表株HENAN-HEB和CHsx1401親緣關(guān)系較近，同屬于NADC30-like亞群，但仍屬于相對(duì)獨(dú)立的分支。

3 結(jié)論與討論

自1996年我國首次報(bào)道從豬群中分離PRRSV以來，該病就成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一[16-17]。2006年夏天，由變異的PRRSV引起的無名高熱病席卷幾乎全國所有養(yǎng)豬地區(qū)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。研究證實(shí)，該病原為Nsp2基因處缺失不連續(xù)30個(gè)氨基酸的毒株。為此，相關(guān)研究人員先后研制出高致病性PRRSV滅活疫苗及弱毒疫苗，并且在全國范圍內(nèi)強(qiáng)制免疫，在很大程度上遏制了高致病性PRRSV在我國的流行。但從2013年開始，多個(gè)省份又相繼報(bào)道在豬場發(fā)現(xiàn)了與美國NADC30毒株同源性很高的毒株，研究人員將其命名為NADC30-like毒株[18]。NADC30-like毒株最顯著的基因特征是Nsp2區(qū)存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，隨后的分子流行病學(xué)調(diào)查研究也顯示，NADC30-like毒株在我國多個(gè)地區(qū)逐漸呈流行態(tài)勢[19-20]。

本研究在豬場爆發(fā)母豬群突發(fā)大規(guī)模流產(chǎn)時(shí)，對(duì)可能導(dǎo)致母豬流產(chǎn)的主要常見病原（PRRSV、豬瘟、豬偽狂犬、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、弓形蟲與布魯氏菌?。┻M(jìn)行了排查，僅PRRSV呈陽性，其余均為陰性，這個(gè)結(jié)果也證實(shí)了免疫工作比較到位的規(guī)?；i場引起母豬大規(guī)模流產(chǎn)的病原依然是PRRSV。當(dāng)前豬場感染PRRSV具有多種形式：弱毒疫苗的返強(qiáng)和持續(xù)感染、野毒感染、野毒與弱毒疫苗共感染、外來毒（如NADC30等）感染、野毒與外來毒混合感染、各種重組病毒感染等。本試驗(yàn)克隆了PRRSV病毒株的Nsp2和ORF5基因，并與已知代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，本次疫情的病原PRRSV XJTK雖然與NADC30及NADC30-like國內(nèi)分離株同源關(guān)系很近，屬于NADC30-like亞群，但在遺傳進(jìn)化樹中仍然處于相對(duì)獨(dú)立的分支。這可能與新疆地處祖國邊境，地理位置偏遠(yuǎn)導(dǎo)致當(dāng)?shù)豍RRSV與國內(nèi)其它省份PRRSV在基因進(jìn)化上差異較大所致，因此當(dāng)?shù)匾岸九cNADC30-like毒株重組后產(chǎn)生的病毒也極具本土特異性。目前，我國的PRRSV疫苗主要是以經(jīng)典型和高致病性PRRSV為親本研發(fā)而來的，對(duì)NADC30-like毒株沒有或僅有微弱的交叉保護(hù)力，這也解釋了為何豬場在應(yīng)用免疫PRRSV疫苗后依然會(huì)暴發(fā)由PRRSV感染而導(dǎo)致此次疫情的原因，長期注射疫苗可能造成新型變異毒株的出現(xiàn)，從而降低免疫效果，因此要合理使用減毒活疫苗。

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