天津地區(qū)日本沼蝦群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析

王永辰 姜巨峰 劉肖蓮 宋立民 吳會民 李楠 馬林 高哲穎

摘? ? 要：為了評估天津地區(qū)日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）野生種質資源遺傳背景，采用9對微衛(wèi)星分子標記（Mn33、Mn37、Mni04、Mni01、Mni06、Mni76、Mni13、Mni40、Mni58）對日本沼蝦4個野生群體（YDXH、DLJH、XQLH和YQSK）進行了遺傳多樣性研究。結果表明，9對微衛(wèi)星引物在日本沼蝦4個群體中的等位基因數(shù)（Na）為3～12，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.976 9～10.816 5，觀測雜合度（Ho）為0.285 7～0.975 0，期望雜合度（He）為0.494 2～0.896 7，多態(tài)信息含量（PIC）為0.474 9～0.888 0，說明日本沼蝦群體的遺傳多樣性水平較高;分子方差分析（AMOVA）顯示，群體中僅有2.04%（P<0.01）的遺傳變異來源于群體間，97.96%（P<0.01）的變異來源于群體內，表明遺傳差變異主要存在于個體間;群體間遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.010 4～0.037 7，說明群體間的遺傳分化程度并不明顯;基于群體間Neis遺傳距離采用UPGMA法對4個群體進行聚類樹構建，永定新河（YDXH）與獨流減河（DLJH）首先聚為一支，其次與西七里海（XQLH）聚為一支，最后與于橋水庫（YQSK）聚為一支。

關鍵詞：天津地區(qū);日本沼蝦;微衛(wèi)星;遺傳多樣性

中圖分類號：S966.12; Q347? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.009

Abstract： In order to investigate the genetic background of wild Macrobrachium nipponense resources in Tianjin， nine microsatellite markers （Mn33， Mn37， Mni04， Mni01， Mni06， Mni76， Mni13， Mni40， Mni58） were used to analyze the genetic diversity of four populations of M. nipponense （YDXH， DLJH， XQLH and YQSK）. The results demonstrated that number of alleles （Na） was 3～12， number of effective allele （Ne） was 1.976 9～10.816 5， observed heterozygosity （Ho） was 0.285 7～0.975 0， expected heterozygosity （He） was 0.494 2～0.896 7 and polymorphic information content（PIC） was 0.474 9～0.888 0， indicating that the four populations had a high genetic diversity. AMOVA analysis revealed that 2.04% of the total genetic variation was among populations and 97.96% was among individuals. Genetic differentiation index（Fst） （0.010 4～0.037 7） suggested that there was low genetic differentiation among these populations. The UPGMA phylogenetic tree revealed that YDXH and DLJH clustered into one group， then to XQLH， finally to YQSK.

Key words： Tianjin; Macrobrachium nipponense; microsatellite; genetic diversity

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense），俗名河蝦、青蝦，隸屬甲殼綱（Crustarcea）十足目（Decaplda）長臂蝦科（Palaemonidae）沼蝦屬（Macrobrachium），于我國各地淡水水域中均有分布[1]，據統(tǒng)計，2016年全國日本沼蝦養(yǎng)殖總產量已達到27.26萬t[2]，是產量較高的淡水養(yǎng)殖經濟蝦類之一[3]。近年來，日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時，也面臨著性早熟、生長慢、抗病力下降等一系列問題。另外，由于無序開發(fā)導致天然生境改變等因素使野生優(yōu)異種質也遭到一定程度的破壞，資源量下降，限制了日本沼蝦的可持續(xù)發(fā)展。因此，日本沼蝦的種質資源研究逐漸被重視并廣泛開展[4-10]。

通過對群體遺傳多樣性和遺傳結構的研究，可以了解種群種質資源現(xiàn)狀，評估其育種潛力，這是選育良種的前期基礎工作[6]。分子生物學的快速發(fā)展，促進了分子遺傳標記技術的進步，其作為一種檢測生物遺傳多樣性的方法被廣泛應用，在種群遺傳結構分析、種質鑒定、親緣關系分析及遺傳連鎖圖譜構建等方面發(fā)揮著十分重要的作用[11-12]。微衛(wèi)星（SSR）是一種應用比較廣泛的分子遺傳標記，已應用于太湖、洪澤湖、錢塘江、洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖、白洋淀、衡水湖、微山湖、洪澤湖、女山湖、巢湖、姑溪河、南漪湖、長江東至段、升金湖等湖、河、江段日本沼蝦的遺傳多樣性研究[5，9，13-16]。天津地處華北平原東北部、海河流域下游，歷史上水量豐沛，流經天津的海河干流及南運河、北運河、子牙河、永定河、潮白河、薊運河等河流，構成了豐富的水系，被譽為“九河下梢”，同樣孕育著豐富的日本沼蝦野生種質資源。目前仍未見專門針對天津地區(qū)日本沼蝦遺傳多樣性研究的相關報道。

本研究利用SSR標記，分析了天津地區(qū)永定新河、獨流減河、西七里海和于橋水庫4個日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性，探討其遺傳結構和群體間遺傳關系，以期為天津地區(qū)野生日本沼蝦種質資源的保護和合理開發(fā)利用以及品種改良提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采集天津地區(qū)日本沼蝦野生群體4個，分別為永定新河群體（YDXH）、獨流減河群體（DLJH）、西七里海群體（XQLH）和于橋水庫群體（YQSK），具體位置詳見圖1，每個群體的樣本數(shù)分別為40，40，38和40尾。剪取尾部肌肉用無水乙醇固定后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的組織基因組提取試劑盒（DP304）提取基因組DNA，用核酸蛋白儀（Nanodrop 基因有限公司）測量DNA濃度，并根據測量結果將DNA稀釋到100 μg·mL-1。

1.3 微衛(wèi)星擴增

本試驗所用引物來自于已公開發(fā)表的引物[7，14-15，17-18]，委托上海生工生物工程技術服務公司合成。引物的基本信息見表1。

PCR反應總體積10? μL，包括10×buffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 0.8 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，5 U·μL-1 Taq酶0.1 μL，10 ng·μL-1基因組DNA 1.0 μL，用無菌水補足體積至10? μL。PCR反應程序：95? ℃預變性5? min;95? ℃? 30? s，退火溫度30? s，72? ℃ 45? s， 共35個循環(huán); 最后72? ℃延伸10? min。

1.4 毛細管電泳分析

PCR反應體系：1 μL PCR產物，0.1 μL GeneScan-500? LIZ Size Standard，9.9? μL HI-DI Formamide。反應體系于95? ℃條件下5? min，于冰上冷置5? min，利用ABI3730基因分析儀（Applied Biosystems）進行毛細管電泳。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計及分析

根據產物片段大小讀取各個位點的基因型，利用POPGene1.32軟件計算出群體的等位基因數(shù)（Number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、期望雜合度（（Expected heterozygosity，He）、觀測雜合度（Observed heterozy-gosity，Ho）、群體近交指數(shù)（Within population inbreeding coefficient，F(xiàn)is）以及群體間的Neis遺傳距離（Genetic Distance）。根據等位基因頻率分布，利用PIC-Calc軟件計算出微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）。利用Genepop進行哈迪-溫伯格平衡檢驗，根據P值判斷位點是否處于平衡狀態(tài)。根據公式D=（Ho-He）/He計算遺傳偏離指數(shù)。

利用軟件ARLEQUIN 3.1計算出兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)（Population differentiation coefficient，F(xiàn)st），并基于遺傳距離用MEGA5軟件構建UPGMA系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 位點多態(tài)性

部分位點的毛細管電泳峰圖如圖2、圖3和圖4所示，4個日本沼蝦群體中的遺傳多樣性指數(shù)如表2所示，等位基因數(shù)Na介于10～22之間;有效等位基因數(shù)Ne介于2.422 7～10.130 6之間;期望雜合度He介于0.587 2～0.901 3之間;觀測雜合度Ho介于0.448 3～0.926 7之間;多態(tài)信息含量PIC介于0.550 4～0.893 1之間，大于0.5，所有位點均具有較高的多態(tài)性。

2.2 日本沼蝦群體遺傳多樣性分析

日本沼蝦4個群體的遺傳多樣性指數(shù)見表3。4個群體中，平均等位基因數(shù)（Na）最大的是永定新河（9.888 9），最小的是于橋水庫（8.777 8）。與觀察得到的等位基因數(shù)相比較，每個位點的有效等位基因數(shù)（Ne）占平均等位基因數(shù)（Na）的比例偏低，表明每個等位基因在群體中的分布并不均勻，其中等位基因分布最不均勻的是位點Mni58，該位點在4個群體中的等位基因數(shù)（Na）介于9～13之間，有效等位基因數(shù)（Ne）介于2.363 6～3.243 1之間，從毛細管電泳峰（圖4）可以看出，在Mni58中，等位基因290/298出現(xiàn)頻率較高，其他等位基因出現(xiàn)頻率較低。在所有群體中平均期望雜合度（He）最高的是獨流減河群體（0.741 1），接下來的依次是西七里海群體（0.738 0）、于橋水庫群體（0.730 8）、永定新河群體（0.634 2），除永定新河群體外，其他3個群體的平均觀測雜合度值（Ho）均低于平均期望雜合度。對6個群體所有位點進行哈迪-溫伯格平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)在經過Bonferroni校正后，永定新河群體有4個位點，獨流減河群體有4個位點，西七里海群體有3個位點，于橋水庫有1個位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.01）。近交系數(shù)（Fis）結果表明，各個位點在4個群體中的Fis介于-0.290～0.530之間，在4個群體中僅于橋水庫群體各位點的近交系數(shù)均值（-0.009）小于0，表明該群體在進化過程中有外來基因的參與，而其他3個群體的近交系數(shù)均大于0，在群體演變過程中存在近交現(xiàn)象。

2.3 日本沼蝦群體遺傳分化指數(shù)

對日本沼蝦4個群體的Fst值分別進行分析，結果見表4。遺傳分化指數(shù)Fst<0.05表明群體間存在較小的遺傳差異;0.050.25表明群體間存在很大的遺傳差異。從表4中可看出0.010 4

由表5可知，日本沼蝦群體間Neis遺傳距離介于0.054 7～0.097 7之間，遺傳相似度介于0.906 9～0.946 7之間。其中，獨流減河與永定新河群體間的遺傳距離最近，遺傳相似度最高，而于橋水庫與獨流減河的遺傳距離最遠，遺傳相似度最低。根據遺傳距離利用UPGMA對4個日本沼蝦群體進行聚類分析，結果（圖5）表明，永定新河與獨流減河首先聚為一支，其次與西七里海聚為一支，最后與于橋水庫聚為一支。

AMOVA分析結果（表6）表明，群體中僅有2.04%（P<0.01）的遺傳變異來源于群體間，而97.96%（P<0.01）的變異來源于群體內，說明遺傳差異主要存在于個體間，個體間的遺傳變異遠大于群體之間的遺傳變異。

3 結論與討論

地球上所有生命體攜帶的遺傳信息的總和稱之為遺傳多樣性，遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種在復雜多變的環(huán)境中維持生存并取得適應性進化的基礎，一個物種的遺傳變異越大通常其遺傳進化潛力會越高。分子遺傳標記技術已經被廣泛用于生物遺傳多樣性的檢測，其中微衛(wèi)星分子標記（SSR）與其他分子遺傳標記相比具有多態(tài)性豐富、共顯性等優(yōu)點，故在分析水產動物遺傳多樣性方面SSR法便成為了比較常用的分子標記[19]。

微衛(wèi)星位點的多態(tài)性可以用多態(tài)信息含量（PIC）來衡量，PIC通常能夠反映某群體的遺傳變異程度、位點多樣性等[19]。按照Botstein等[20]描述的劃分標準，當某個群體的PIC>0.50時，則表明該位點為高度多態(tài);當0.25

基因雜合度表示群體中某個位點上雜合子的頻率，反映出群體的遺傳變異程度，通常被認為是衡量群體遺傳變異的最適參數(shù)[21]。本研究檢測的日本沼蝦永定新河、獨流減河、西七里海和于橋水庫群體的平均觀測雜合度依次為0.732 9，0.693 8，0.661 4和0.747 0，平均期望雜合度依次為0.634 2，0.741 1，0.738 0和0.730 8，4個樣本群體雜合度均較高，說明具有較好的選育潛力。

哈迪-溫伯格平衡是指一個較大的、隨機交配的種群，在沒有遷移、選擇、突變的前提下，群體中各基因頻率和基因型頻率是穩(wěn)定不變的，即保持著基因平衡。在本試驗中有部分微衛(wèi)星位點出現(xiàn)了偏離哈迪-溫伯格平衡的現(xiàn)象，這可能與群體生存環(huán)境變化或過度捕撈等人為影響，日本沼蝦發(fā)生小種群同型交配，產生不同程度的遺傳漂變有關。哈迪-溫伯格遺傳偏離指數(shù)D主要反映的是Ho與He之間的平衡關系，D值越接近于0，說明基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài);D值越偏離0，基因型分布越偏離平衡狀態(tài);D大于0則說明雜合子過剩，D小于0說明雜合子缺失[19]。本研究中4個群體僅在少部分位點表現(xiàn)為雜合子過剩而大部分位點表現(xiàn)為雜合子缺失，雜合子缺失產生的原因除了遺傳漂變之外，也有可能是微衛(wèi)星位點中無效等位基因的存在[22]，使試驗分析過程中把雜合子當作純合子而導致結果中純合子過剩，從而影響哈迪-溫伯格平衡。

天津地區(qū)日本沼蝦群體間Nei氏遺傳距離為0.054 7～0.097 7，小于范武江等[23]的研究結果（0.821 6～0.832 1），遺傳分化指數(shù)Fst的范圍為0.010 4～0.037 7，表明4個群體間遺傳距離較近，遺傳分化程度處于較低水平。相關研究表明，子代表現(xiàn)型并非隨著親本的遺傳距離越大而越好。如魯翠云等[24]采用微衛(wèi)星標記指導鏡鯉（Cyprinus carpio L.）家系親本的配組，生長對照結果顯示親本個體間的遺傳距離與子一代的生產性能之間相關性較小，遺傳距離在0.5～0.7之間的親本的子一代具有較好的生產性能;畢金貞等[25]在牙鲆（Paralichthys olivaceus）的相關研究中也獲得了相似的結果，不同遺傳距離范圍內，親本間遺傳距離與后代生長速度之間呈現(xiàn)不同的相關性，一些遺傳距離很大或者很小的親本，其后代都表現(xiàn)出比較慢的生長速度。對牙鲆的研究[25]表明遺傳距離在0.257 8～0.595 8之間時，親本間遺傳距離越大，后代生長速度則越快;在0.609 9～0.660 4之間時，親本遺傳距離與后代生長速度間沒表現(xiàn)出顯著的相關性;在0.664 0～0.977 3之間時，親本遺傳距離越大，后代生長速度則越慢。而對合浦珠母貝（Pinctada fucata）的研究[26]表明親本遺傳距離在0.535 5～0.569 6之間時，與子代生長速度呈顯著正相關，親本遺傳距離在0.649 6～1.000 0之間時，與子代生長速度呈顯著負相關關系。本研究中，4個日本沼蝦群體的遺傳多態(tài)性較高，但相互之間的遺傳距離較小，說明在下一步研究中可用這些群體與其他地理關系較遠的日本沼蝦群體，如鄱陽湖群體、洞庭湖群體等進行遠緣雜交，來提高其子代的表現(xiàn)性狀。

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