酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測白條鴨表皮組織中的脫氫松香酸

仇新媛 姚忠 耿志明 馬晶晶 李鵬鵬

摘 要：通過優(yōu)化抗原包被質(zhì)量濃度、抗體稀釋倍數(shù)及二抗稀釋倍數(shù)等參數(shù)，建立白條鴨表皮組織中脫氫松香酸（dehydroabietic acid，DHAA）含量的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法。白條鴨表皮組織中的DHAA用甲醇提取，經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋，使用酶標(biāo)板進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：最佳抗原包被質(zhì)量濃度為1.0 ?g/mL，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶6 400，最佳二抗稀釋倍數(shù)為1∶10 000;ELISA方法的檢測限及檢測范圍分別為41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g;在100～5 000 ng/g添加量范圍內(nèi)，DHAA回收率為78.2%～97.2%;實際樣品分析結(jié)果顯示，市場流通領(lǐng)域中白條鴨表皮組織中DHAA的檢出率達(dá)到87%，含量范圍為118.6～1 199.2 ng/g。

關(guān)鍵詞：白條鴨表皮組織;松香;脫氫松香酸;殘留;酶聯(lián)免疫吸附測定

Abstract： An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was developed for determination of dehydroabietic acid （DHAA） in duck skin. DHAA in duck skin samples was extracted with methanol， followed by dilution with phosphate buffer saline （PBS）， and determined by an ELISA reader. Results indicated that the optimal coating antigen concentration and the optimal dilution of antiserum were found to be 1.0 ?g/mL and 1：6 400， respectively， while the optimal dilution of HRP-IgG antibody was 1：10 000， the limit of detection and the working concentration range were 41.0 ng/g and from 100.0 to 20 150.0 ng/g respectively. The recoveries from spiked samples at concentration levels of 100–5 000 ng/g were in the range of 78.2%–97.2%. When the method was applied to real samples， DHAA was detectable in up to 87% of the samples at levels of 118.6–1 199.2 ng/g.

Keywords： duck skin; rosin; dehydroabietic acid; residue; enzyme-linked immunosorbent assay

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190909-214

中圖分類號：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）12-0045-05

松香是來源于松樹的一種天然物質(zhì)，包含多種樹脂酸，其中松香酸（abietic acid，AA）和脫氫松香酸（dehydroabietic acid，DHAA）是其主要成分。AA和DHAA能顯著抑制水蚤、虹鱒魚等的生長發(fā)育[1]。在細(xì)胞毒理學(xué)方面，AA可導(dǎo)致人體肺泡上皮細(xì)胞溶解，而DHAA能夠促進(jìn)人體上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞死亡并對人體紅細(xì)胞有毒害作用[2]。作為一種普通工業(yè)原料，松香被廣泛用于肥皂、造紙、油漆涂料等領(lǐng)域。AA和DHAA廣泛存在于造紙廠廢水中，在日用消費品，如藥劑、化妝品等中也常有檢出，甚至可以通過包裝材料遷移進(jìn)入食品中[3-4]。

因加熱后具有優(yōu)良的黏附特性，松香曾被畜禽屠宰加工企業(yè)廣泛用于畜禽屠宰，尤其是鴨（鵝）屠宰的二次脫毛。值得關(guān)注的是，殘留在水禽胴體中的AA和DHAA經(jīng)過烹飪加工后依然殘留在水禽肉制品中，給消費者健康帶來潛在危害[5]。2009年，我國《食品安全法》禁止在畜禽屠宰中使用松香脫毛，但是中小畜禽加工企業(yè)違禁使用松香脫毛的現(xiàn)象仍然十分嚴(yán)重。

AA和DHAA作為松香殘留的主要標(biāo)志物，一般通過氣相色譜（gas chromatographic，GC）法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行分析[6-8]。相對而言，HPLC的應(yīng)用更為普遍[9-11]。酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法靈敏度高，具有特異性強、成本低、檢測容量大等特點，適用于大批量樣本中微量污染物的快速分析[12-14]。近年來，ELISA技術(shù)發(fā)展迅速，除醫(yī)藥、臨床領(lǐng)域外，在環(huán)境監(jiān)測、食品安全等方面也獲得廣泛應(yīng)用，并已成為有機污染物殘留快速檢測的主要分析手段之一[15-17]。本課題前期建立了水禽肉制品中AA和DHAA同時測定的HPLC-紫外-熒光分析方法，同時成功合成了DHAA的人工抗原，并通過免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體[18-20]。因此，本研究通過優(yōu)化抗原包被質(zhì)量濃度、抗體稀釋倍數(shù)及二抗稀釋倍數(shù)等參數(shù)，進(jìn)一步建立白條鴨表皮組織中DHAA含量的間接競爭ELISA檢測方法，為畜禽產(chǎn)品中松香殘留快速分析方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

23 種品牌冷凍白條鴨 南京冷鏈批發(fā)市場。

AA標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%） 北京百靈威科技有限公司;DHAA標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、異海松酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、長葉松酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%）、海松酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%） 北京樂博生物科技有限公司;辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G）（IgG-HRP） 上海拜力生物科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch2全波長酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;Biofuge stratos高速離心機 德國Heraeus公司;T25高速勻漿機 德國IKA公司;酶標(biāo)板 上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHAA人工抗原合成及抗體制備

前期研究中合成了DHAA的人工抗原并制備了多克隆抗體[21]。簡述如下：以脫氫松香胺（dehydroabietylamine，DHAM）作為半抗原，首先與琥珀酸酐（succine anhydride，SUC）進(jìn)行?；磻?yīng)，生成DHAM-SUC，通過紅外光譜、核磁共振及質(zhì)譜進(jìn)行表征;DHAM-SUC進(jìn)一步分別與牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，合成完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH，偶聯(lián)比分別為12∶1和35∶1;用DHAM-SUC-KLH免疫家兔，制備、純化抗血清;以DHAM-SUC-BSA為包被抗原，采用間接ELISA測定抗血清滴度。結(jié)果表明，4號新西蘭大白兔的抗血清效價達(dá)1.28×105，可以用于建立白條鴨表皮組織中DHAA含量的間接競爭ELISA方法。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量的DHAA標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋成質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120 ng/mL的系列工作溶液。

1.3.3 間接競爭ELISA測定步驟

參考Gurmit等[22]的方法。以一定質(zhì)量濃度的抗原包被96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃孵育過夜;12 h后傾去孔內(nèi)液體，用磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffer saline with Tween-20，PBST）洗滌3 次，每次5 min，在干凈的吸水紙上拍干;用質(zhì)量濃度2 g/100 mL明膠（純水配制）進(jìn)行封閉，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3 次后拍干;加入系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（或被檢抗原）和一定稀釋倍數(shù)的抗血清，按體積比1∶1混合后，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3 次后拍干;加入一定稀釋倍數(shù)的羊抗兔IgG-HRP，每孔100 μL，37 ℃孵育5 min，PBST洗滌3 次后拍干;加入新鮮配制的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，每孔100 μL，顯色10 min;每孔加入50 μL 2 mol/L濃硫酸終止反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔光密度（optical density，OD） 值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制率曲線。抑制率按下式計算。

1.3.4 樣品前處理

參考張?zhí)K珍等[23]的方法，并稍作修改。分別在每只肉鴨頸、翅、胸、背、腿5 個部位取表皮組織，剪碎、混合均勻備用。稱取2 g混合樣品置于10 mL離心管，加入4 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液加入1.5 mL PBS混合后待ELISA檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS statistics 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接競爭ELISA條件的優(yōu)化

在前期實驗中，利用DHAM為半抗原合成了DHAA的完全抗原，并通過免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體。合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性，獲得的多克隆抗體具有較好的靈敏度[21]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上通過優(yōu)化一系列參數(shù)，包括抗原包被質(zhì)量濃度、抗體稀釋倍數(shù)、二抗稀釋倍數(shù)等，建立白條鴨表皮組織中DHAA殘留檢測的間接競爭ELISA方法。

采用三維滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度及抗體稀釋倍數(shù)。設(shè)置抗原包被質(zhì)量濃度范圍為0.0～4.0 μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)范圍為1∶800～1∶12 800。由圖1可知，按照OD450 nm接近于1.0所對應(yīng)實驗組合為最佳組合的標(biāo)準(zhǔn)，確定包被抗原質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)為1∶6 400。

采用單因素控制法，在1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000二抗稀釋倍數(shù)條件下分別進(jìn)行間接競爭ELISA分析，按照陽性血清OD450 nm/陰性血清OD450 nm比值最大的選取原則，確立二抗稀釋倍數(shù)為1∶10 000。

2.2 線性范圍、檢出限配制質(zhì)量濃度范圍為10～10 240 ng/mL的DHAA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下進(jìn)行間接競爭ELISA分析，繪制抑制率曲線。結(jié)果表明，線性范圍為10～5 120 ng/mL，回歸方程為y=26.03x-13.87（R2=0.992），式中：x為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)，y為抑制率。

在間接競爭ELISA方法中，最低檢測限定義為抑制率10%對應(yīng)的分析物質(zhì)量濃度，工作質(zhì)量濃度范圍定義為抑制率20%～80%對應(yīng)的分析物質(zhì)量濃度。通過線性回歸方程計算可知，方法檢測限為8.2 ng/mL，工作質(zhì)量濃度范圍為20.0～4 030.0 ng/mL，抑制率50%時對應(yīng)的分析物質(zhì)量濃度為283.8 ng/mL。根據(jù)鴨表皮組織的前處理條件，鴨表皮組織中DHAA的檢測限及檢測范圍分別為41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g。根據(jù)Zhu Yongzhi等[24]的報道，使用松香脫毛后，鴨表皮組織中的DHAA含量范圍為160～3 750 ng/g。因此本研究建立的間接競爭ELISA方法工作質(zhì)量濃度范圍可以滿足鴨表皮組織中DHAA的檢測需求。

2.3 交叉反應(yīng)實驗

松香是樹脂酸混合物，除了AA和DHAA還包括其他樹脂酸，如長葉松酸、海松酸、異海松酸等[25-27]，這些樹脂酸在松香中含量雖少，但它們都是三環(huán)二萜類含氧化合物，可能會和抗體產(chǎn)生反應(yīng)，從而干擾檢驗結(jié)果[28-29]。通過交叉反應(yīng)評價本研究建立的間接競爭ELISA方法檢測DHAA的特異性。

分別配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的AA、長葉松酸、海松酸、異海松酸4 種標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用PBS梯度稀釋成系列工作溶液，進(jìn)行間接競爭ELISA分析，得到抑制率曲線。根據(jù)各線性回歸方程計算抑制率分別為20%、50%、80%時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度。

由表1可知，AA、長葉松酸、海松酸、異海松酸4 種樹脂酸與DHAA的交叉反應(yīng)率均小于3.00%，表明這些結(jié)構(gòu)類似的樹脂酸對DHAA測定的影響很小，可以忽略不計，因此，本研究所建立的間接競爭ELISA檢測方法對DHAA具有優(yōu)良的特異性。

2.4 精密度實驗

選擇3 個DHAA含量不同的白條鴨樣本開展精密度實驗，包括日內(nèi)和日間精密度實驗，評價建立的間接競爭ELISA方法的重復(fù)性。日內(nèi)精密度實驗在1 d內(nèi)進(jìn)行、共設(shè)置6 個重復(fù);日間精密度實驗每天3 個重復(fù)、連續(xù)進(jìn)行4 d實驗。

由表2可知，日內(nèi)和日間精密度實驗測定結(jié)果為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.9%～8.7%和5.5%～10.2%，表明本研究建立的間接競爭ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 回收率實驗

選擇3 個DHAA含量不同的白條鴨樣本，進(jìn)行4 個不同水平的添加回收實驗，評價建立的間接競爭ELISA方法的準(zhǔn)確度。由表3可知，回收率范圍為78.2%～97.2%，表明所建立的間接競爭ELISA檢測方法準(zhǔn)確度較高。

2.6 實際樣品分析

用所建立的間接競爭ELISA方法分別對23 個白條鴨樣本中的DHAA含量進(jìn)行檢測，并與HPLC-FLD方法的測定結(jié)果進(jìn)行對比。由表4可知，2 種方法的測定結(jié)果無明顯差異。ELISA方法測定結(jié)果表明，23 個白條鴨樣本中，20 個樣本檢出DHAA，陽性率達(dá)87.0%，DHAA含量范圍為118.6～1 199.2 ng/g，無論是陽性率還是DHAA殘留水平均與Zhu Yongzhi等[30]的報道基本一致。因此，本研究所建立的白條鴨表皮組織中DHAA含量的間接競爭ELISA分析方法準(zhǔn)確度高，可以滿足流通領(lǐng)域中白條鴨表皮組織中DHAA含量的快速分析。

3 結(jié) 論

通過間接競爭ELISA參數(shù)的優(yōu)化，建立白條鴨表皮組織中DHAA含量的間接競爭ELISA測定方法。方法的檢測限及檢測范圍分別為41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g?；厥章蕦嶒?、交叉反應(yīng)實驗及實際樣本測定結(jié)果表明，本研究建立的間接競爭ELISA方法具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確度，操作簡便、快捷，適用于大樣本量的白條鴨中DHAA殘留量的分析檢測，也可用于市場流通領(lǐng)域中違禁使用松香脫毛加工的白條鴨的鑒別。

參考文獻(xiàn)：

[1] KAMAYA Y， TOKITA N， SUZUKI K， et al. Effects of dehydroabietic acid and abietic acid on survival， reproduction， and growth of the crustacean Daphnia magna[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2005， 61（1）： 83-88. DOI：10.1016/j.ecoenv.2004.07.007.

[2] PENG Guomei， ROBERTS J C. Solubility and toxicity of resin acids[J]. Water Research， 2000， 34（10）： 2779-2785. DOI：10.1016/s0043-1354（99）00406-6.

[3] LISS S N， BICHO P A， SADDLER J N. Microbiology and biodegradation of resin acids in pulp mill effluents： a mini review[J]. Canadian Journal of Microbiology， 1997， 43（7）： 599-611. DOI：10.1139/M97-086.

[4] SMITH P A， GARDNER D R， DROWN D B， et al. Detection of resin acid compounds in airborne particulate generated from rosin used as a soldering flux[J]. American Industrial Hygiene Association Journal， 1997， 58（12）： 868-875. DOI：10.1080/15428119791012207.

[5] 張?zhí)K珍， 卞歡， 王道營， 等. 肉鴨經(jīng)松香脫毛后表皮松香殘留的薄層色譜檢測研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2013， 25（5）： 117-119. DOI：10.19386/j.cnki.jxnyxb.2013.05.035.

[6] MITANI K， FUJIOKA M， UCHIDA A， et al. Analysis of abietic acid and dehydroabietic acid in food samples by in-tube soid phase microextraction coupled with liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2007， 1146（1）： 61-66. DOI：10.1016/j.chroma.2007.01.118.

[7] 張?zhí)K珍， 卞歡， 王道營， 等. 食品中松香殘留檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（8）： 307-308. DOI：10.3969/j.issn.1002-1302.2013.08.116.

[8] 張?zhí)K珍， 耿志明， 王道營， 等. 固相萃取-高效液相色譜法檢測肉鴨表皮組織中的松香酸[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（4）： 82-85. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201404017.

[9] KERSTEN P J， KOPPER B J， RAFFA K F， et al. Rapid analysis of abietanes in conifers[J]. Journal of Chemical Ecology， 2006， 32（12）： 2679-2685. DOI：10.1007/s10886-006-9191-2.

[10] NILSSON U， BERGLUND N， LINDAHL F， et al. SPE and HPLC/UV?of resin acids in colophonium-containing products[J]. Journal of Separation Science， 2008， 31（15）： 2784-2790. DOI：10.1002/jssc.200800210.

[11] LEE B L， KOH D， ONG H Y， et al. High performance liquid chromatographic determination of dehydroabietic and abietic acids in traditional Chinese medications[J]. Journal of Chromatography A， 1997， 763（1）： 221-226. DOI：10.1016/S0021-9673（96）00901-6.

[12] 肖敬川， 王順蘭， 曹卉. 血清碳酸酐酶Ⅱ抗體ELISA方法的建立及應(yīng)用評價[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志， 2018， 39（8）： 953-955. DOI：10.3969/j.issn.1673-4130.2018.08.016.

[13] YANG Fan， WANG Huan， YANG Juan， et al. An indirect competitive immunoassay for analysis of carminic acid in meat products[J]. Food Analytical Methods， 2017， 10（11）： 3687-3693. DOI：10.1007/S12161-017-0947-6.

[14] LIN Lu， JIANG Wei， XU Liguang， et al. Development of IC-ELISA and immunochromatographic strip assay for the detection of flunixin meglumine in milk[J]. Food and Agricultural Immunology， 2018， 29（1）： 193-203. DOI：10.1080/09540105.2017.1364710.

[15] 布冠好， 朱婷偉， 陳復(fù)生， 等. 大豆球蛋白間接競爭ELISA檢測方法的建立[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2014， 35（4）： 1-5; 11. DOI：10.16433/j.cnki.issn1673-2383.2014.04.005.

[16] 張澤英. 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用[J]. 湖北畜牧獸醫(yī)， 2013， 34（10）： 59-61. DOI：10.16733/j.cnki.issn1007-273x.2013.10.027.

[17] 趙芮， 劉磊， 劉麗， 等. 酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析海洋生物中記憶缺失性貝毒[J]. 分析實驗室， 2015， 34（8）： 882-885. DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2015.0191.

[18] LI Yanshen， SHI Weimin， SHEN Jianzhong， et al. Development of a rapid competitive indirect ELISA procedure for the determination of deoxynivalenol in cereals[J]. Food and Agricultural Immunology， 2012， 23（1）： 41-49. DOI：10.1080/09540105.2011.589046.

[19] 楊小康， 張繪艷， 顧建紅， 等. 拉沙里菌素單克隆抗體的研制及間接競爭ELISA檢測方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2017， 44（10）： 3049-3056. DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.10.031.

[20] 姚閩娜， 楊旭， 孫遠(yuǎn)明， 等. 食品中重要有害物殘留快速檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 熱帶生物學(xué)報， 2016， 7（3）： 395-401. DOI：10.15886/j.cnki.rdswxb.2016.03.021.

[21] 卞歡， 仇新媛， 李鵬鵬， 等. 松香人工抗原的合成及多克隆抗體的制備[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報， 2018， 36（6）： 51-57. DOI：10.3969/j.issn.2095-6002.2018.06.008.

[22] GURMIT S， LIGIA V， ANNE-CATHERINE H， et al. Development of a polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for determination of sterigmatocystin in wheat and corn flours[J]. Food Additives and Contaminants： Part A， 2019， 36（2）： 327-335. DOI：10.1080/19440049.2019.1567943.

[23] 張?zhí)K珍， 耿志明， 王道營， 等. 肉鴨表皮組織中脫氫樅酸殘留的SPE-HPLC檢測方法[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（16）： 101-104. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201416019.

[24] ZHU Yongzhi， ZHANG Suzhen， GENG Zhiming， et al. Simultaneous determination of abietic acid and dehydroabietic acid resdues in duck meat by HPLC-PAD-FLD[J]. Food Analytical Methods， 2014， 7（8）： 1627-1633. DOI：10.1007/s12161-014-9798-6.

[25] 刁開盛， 尹顯洪， 王海軍. 松香樅酸結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的理論研究[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2009， 45（8）： 117-123. DOI：10.3321/j.issn：1001-7488.2009.08.021.

[26] 崔國友， 莫炳榮， 陳文納. 脫氫樅酸的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品， 2006， 14（20）： 6-8. DOI：10.3969/j.issn.1008-1100.2006.20.002.

[27] 段文貴， 陳小鵬， 王琳琳， 等. 氫化松香主要化學(xué)組成的研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 2001， 21（1）： 1-6. DOI：10.3321/j.issn：0253-2417.2001.01.001.

[28] 張妤琳， 曹玲， 譚力， 等. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于沉香中非法摻入含松香酸類物質(zhì)的檢測[J]. 中成藥， 2011， 33（5）： 844-847. DOI：10.3969/j.issn.1001-1528.2011.05.032.

[29] 蘇運勝， 呂立盈， 聶少姬. 環(huán)境溫度對去氫樅酸檢測結(jié)果的研究[J]. 化工技術(shù)與開發(fā)， 2012， 41（4）： 32-33. DOI：10.3969/j.issn.1671-9905.2012.04.010.

[30] ZHU Yongzhi， ZHANG Suzhen， GENG Zhiming， et al. Analysis of abietic acid and dehydroabietic acid residues in raw ducks and cooked ducks[J]. Poultry Science， 2014， 93（10）： 2663-2667. DOI：10.3382/ps.2014-04045.