龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷小鼠的影響

琚皇進(jìn) 楊柱 唐東昕 羅莉 龍奉璽 王鏡輝 郭斌

【摘?要】?目的：觀察龍膏對(duì)小鼠順鉑所致腎損傷的影響。方法：40只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和龍膏高、中、低劑量組，每組8只，空白對(duì)照組不作特殊處理，模型對(duì)照組及龍膏高、中、低劑量組以順鉑4mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型，龍膏高、中、低劑量組分別在給順鉑的同時(shí)予20mg/kg/d、10mg/kg/d、5mg/kg/d的龍膏灌胃，模型對(duì)照組給予同體積生理鹽水灌胃，給藥2周后取小鼠腎臟及血清。通過腎臟HE染色切片觀察其腎小管和腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)改變。ELISA檢測(cè)血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及血清胱抑素C（CysC）的含量。結(jié)果：龍膏各治療組與模型對(duì)照組比較血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）及血清胱抑素C（CysC）均下降，且中劑量龍膏治療組下降的最明顯，療效最好，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腎臟的HE染色的病理學(xué)觀察：龍膏能減輕順鉑所致腎小管的萎縮及其上皮細(xì)胞顆粒變性。結(jié)論：龍膏對(duì)小鼠順鉑所致腎損傷具有改善作用。

【關(guān)鍵詞】?龍膏;順鉑;腎損傷;小鼠

【中圖分類號(hào)】R285.5???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號(hào)】1007-8517（2019）24-0018-05

Long Gao Mitigate Renal Injury of Mice after Cis-platinum Chemotherapy

JU Huangjin1，2?YANG Zhu1?TANG Dongxin3*?LUO Li3?LONG Fengxi1?WANG Jinghui3?GUO Bin1

1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;2.National Traditional Chinese Medicine Hospital of Dejiang County， Guizhou Province ，Dejiang 565200，China;3.The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China

Abstract：Objective Discussion Long gao influence on mice after cis-platinum chemotherapy， renal coefficients， blood urea nitrogen （BUN）， serum creatinine （Scr）， cystatin C （CysC） and renal pathology slices.Methods Cis-platinum 4mg/kg a single intraperitoneal injection of mice to produced renal impairment， administration 5d.The mice were divided into five groups，Blank control group ：Mouse feeder under conventional conditions， without any treatment;Model control group ：Given the same volume of normal saline （0.2mL/10g） gavage;Long gao high dose group ：Giving cisplatin administered simultaneously 20mg/kg/d of high-dose Long gao gavage;Long gao middle dose group ：Giving cisplatin administered simultaneously 10mg/kg/d of middle-dose Long gao gavage;Long gao low dose group ：Giving cisplatin administered simultaneously 5mg/kg/d of low-dose Long gao gavage;Mice were sacrificed on day 14，take blood and renal，Using kit of ELISA detection of serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、 cystatin C （CysC），renal done pathological section.Results Cisplatin after chemotherapy mice serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、cystatin C （CysC） with before chemotherapy were significantly higher，Long gao treatment serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、 cystatin C （CysC） compared with Model control group decreased significantly， and middle dose Long gao treatment group decreased most significantly， the best effect.Compare with model control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Observation of pathological changes of renal use HE staining：Blank control group： normal renal tissue structures， clear boundaries between the various structures.Model control group： multifocal renal tubular atrophy， with renal tubular compensatory hypertrophy. Tubular epithelial cell denaturation for large number of particles， diffuse infiltration of lymphocytes and monocytes，can seen a lot of tubular protein casts in renal.Three Long gao treatment groups： focal renal tubular epithelial cells granular degeneration， focal lymphocytic infiltration visible focal tubular protein casts.Conclusion Long gao can significantly reduce serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、 cystatin C （CysC） content，treatment early renal damage induced by cisplatin.To change on the renal pathology is not particularly obvious， but there are still some improvement.

Key?words：Long Gao;DDP;Renal toxicity;Mice

鉑類藥物為大部分腫瘤化療的基石[1]，而順鉑作為臨床中最常用的一種，由于經(jīng)過腎臟代謝[2]，往往出現(xiàn)嚴(yán)重的腎毒性，使得大部分腫瘤病人被迫終止治療;目前西醫(yī)針對(duì)鉑類藥物所致腎毒性主要通過充分的水化來預(yù)防[3]，由于需要長時(shí)間大量液體的輸入，使患者生活質(zhì)量逐漸下降;而中醫(yī)藥在預(yù)防鉑類藥物腎毒性方面具有其獨(dú)特的手段，且往往能獲得佳效。

龍膏[4-5]為我院國醫(yī)大師劉尚義教授經(jīng)驗(yàn)方，由鹿角膠、生熟地黃、桑椹等31味藥物組成，其主要功效為補(bǔ)腎填精、養(yǎng)心安神，方中鹿膠乃血肉有情之品，其補(bǔ)腎培元為君;生熟地黃活氣血，填精益髓，滋水補(bǔ)陰，能退虛熱兼潤燥，為補(bǔ)腎之圣藥;佐以黃柏等寧神益智、交通心腎;砂仁為使，鼓蕩脾胃之氣，用冰糖者亦有甘溫補(bǔ)中、和中緩急之功，諸藥同用，共奏補(bǔ)腎填精、養(yǎng)心安神之效。且在前期的臨床研究[5]中發(fā)現(xiàn)龍膏對(duì)鉑類藥物所致腎損傷的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明龍膏具有改善順鉑所致腎損傷的作用，初步了解其作用機(jī)制，并為臨床運(yùn)用提供更為有利的證據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?采用6～8周齡雄性清潔級(jí)BALB/c近交系小鼠40只，各小鼠體重量（18±2）g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2018-004。

1.2?藥物與試劑?龍膏由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科按原方比例制備膏劑，其由鹿角膠、生熟地黃、黃柏、砂仁等藥物組成，1g膏方含原生藥材2.73g，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。順鉑由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房提供，規(guī)格為10mg/瓶，齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20073652，批號(hào)：AA1A8036A。

1.3?實(shí)驗(yàn)主要儀器?小鼠血清尿素氮（BUN）定量ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20181125）;小鼠血清肌酐（SCr）定量ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20181125）;小鼠血清胱抑素C（CysC）定量ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20181125）。Nikon-TS100型倒置相差顯微鏡（美國）;HH-S2型水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）;Xiang Yi-L600型離心沉淀機(jī)（德國）;萊卡病理切片機(jī)（德國）;電子分析天平（北京德賽公司）。

1.4?分組與造模

1.4.1?實(shí)驗(yàn)分組?隨機(jī)將40只小鼠分成5組，每組8只，空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，龍膏高、中、低劑量組，并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周[4]。

1.4.2?建立腎損傷模型?分別給模型對(duì)照組，龍膏高、中、低劑量組，每組每只小鼠以順鉑4mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型[4]，空白對(duì)照組不予處理，給藥5d（前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)順鉑給藥5天后小鼠出現(xiàn)尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且腎小管多灶狀萎縮伴部分腎小管代償肥大，提示腎損傷模型造模成功）。

1.5?實(shí)驗(yàn)給藥?實(shí)驗(yàn)前，將龍膏加適量蒸餾水濃縮配制成濃度分別為0.25mg/mL、0.5mg/mL及1mg/mL的水溶液備用。給藥組根據(jù)動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)用藥折算方法[6]，得出小鼠每日正常給藥劑量等于10mg/kg并設(shè)為龍膏中劑量組;設(shè)龍膏高劑量組為正常劑量的兩倍為20mg/kg/d;設(shè)龍膏低劑量組為正常劑量組的一半為5mg/kg/d;模型對(duì)照組給予0.2mL/10g/d蒸餾水灌胃;空白組不作任何處理;隔日稱體重1次，并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量[4]。

1.6?觀察指標(biāo)

1.6.1?一般情況?實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組小鼠的精神、活躍度、飲食及毛發(fā)情況，同時(shí)注意各組小鼠是否有飲食差、腹瀉、消瘦及死亡現(xiàn)象。

1.6.2?小鼠體重變化情況?分別稱取小鼠造模前體重及小鼠處死前稱體重，觀察小鼠造模前及用藥后各組的體重變化情況[4，7]。

1.6.3?小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量?龍膏灌胃2周后，禁食24h后稱體重，摘眼球法取血[4]，用離心管迅速接血，常溫靜置1h后，離心，ELISA檢測(cè)小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.6.4?小鼠腎臟系數(shù)及腎臟病理切片?取出雙側(cè)腎臟稱重并計(jì)算腎臟系數(shù);將其中一側(cè)腎固定于4%多聚甲醛中[4]，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞及周圍炎性細(xì)胞浸潤情況和形態(tài)變化。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）比較，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1??一般情況觀察?實(shí)驗(yàn)開始前各組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各組小鼠體重相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)具有可比性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，空白對(duì)照組小鼠的精神狀態(tài)、活躍程度、進(jìn)食情況及毛發(fā)的光澤度均良好，且小鼠體重逐漸增加;模型對(duì)照組及龍膏高、中、低組小鼠則出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、活躍度下降、進(jìn)食減少及毛發(fā)光澤度減低且逐漸出現(xiàn)消瘦等情況，而模型對(duì)照組的癥狀最為突出，龍膏高、中、低組小鼠狀況稍優(yōu)于模型對(duì)照組。隨著用藥時(shí)間的延長，模型對(duì)照組小鼠體重逐漸減輕，各龍膏組小鼠癥狀較前稍得到控制，與同期模型對(duì)照組動(dòng)物相比，活動(dòng)相對(duì)增多，反應(yīng)相對(duì)靈敏，飲食較前增加，但與空白組相比仍有不足。

2.2?小鼠順鉑干預(yù)前、處死前體重變化比較?本次實(shí)驗(yàn)初始動(dòng)物總數(shù)為40只，每組8只。順鉑干預(yù)前各組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。除空白對(duì)照組外其余各組小鼠體重均有明顯下降，且與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型對(duì)照組與龍膏干預(yù)組對(duì)比小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3?小鼠腎臟系數(shù)比較?模型對(duì)照組腎臟系數(shù)顯著上升，與空白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;龍膏各劑量組與模型對(duì)照組比較腎臟系數(shù)均降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而各龍膏干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4?小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量變化?模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;龍膏各劑量組與空白對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），龍膏各劑量組與模型對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.5?各組小鼠腎臟HE染色病理切片情況?空白組：腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管形態(tài)正常，且各結(jié)構(gòu)間界限清晰。模型對(duì)照組：腎小管出現(xiàn)多灶狀萎縮伴部分代償性肥大，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量顆粒變性，彌漫淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，腎小管內(nèi)可見大量蛋白管型。三組龍膏治療組：腎小管上皮細(xì)胞局灶性顆粒變性，灶狀淋巴細(xì)胞浸潤，可見灶狀的腎小管蛋白管型。如圖1所示。

3?討論

順鉑引起腎臟的損害為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所公認(rèn)[8]，通常表現(xiàn)為尿中出現(xiàn)透明管型，血中尿素氨、肌酐及胱抑素C升高等現(xiàn)象?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為鉑類藥物乃外來之邪毒[4]，瘀結(jié)于腎中致瘀毒互結(jié)，傷腎中陽氣，腎陽虧虛以致腎陰陽兩虛，先天受損乃真虛，瘀毒于腎乃假實(shí)，固可標(biāo)本同治，補(bǔ)真虛，瀉假實(shí)。近年的中醫(yī)學(xué)者進(jìn)行了大量的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，運(yùn)用中醫(yī)藥針對(duì)順鉑所致腎損傷在預(yù)防和治療上都取得了巨大進(jìn)展，其減毒增效的優(yōu)勢(shì)日益顯著。根據(jù)中醫(yī)理論，各學(xué)者從不同方向闡述了其治療順鉑所致腎損傷的觀點(diǎn)如：宋燕等[9]認(rèn)為，腎為先天，脾胃乃后天，固以溫陽利水為法用以治療順鉑所致腎損傷取得了一定的療效。楊桂染等[10]則認(rèn)為順鉑所致腎損傷乃心腎兩虛，固其以滋陰安神為法，其效亦可。劉沈林教授[11]認(rèn)為順鉑所致腎損傷乃脾腎兩虛，固其選用健脾養(yǎng)正消癥方，因其健脾益氣、補(bǔ)腎澀精、解毒消癥之功效能有效的保護(hù)化療后的腎功能。劉厚穎等[12]也認(rèn)為補(bǔ)腎乃第一要?jiǎng)?wù)。蔣小燕等[13]認(rèn)為順鉑所致腎損傷除有腎虛外，仍有邪毒瘀內(nèi)，固其采用益腎排毒的治療大法。而除了大量復(fù)方研究外，單藥治療順鉑所致腎損傷療效亦顯著，如黃芪的益氣固腎，現(xiàn)代學(xué)者利用它的提取物及其注射液在臨床上[14-16]用于順鉑所致腎損傷取得了良好的療效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)黃芪做了更為深入的研究，其大量的體外實(shí)驗(yàn)[17-18]證明黃芪的益氣固腎對(duì)順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用明顯。

筆者認(rèn)為精藏于腎，腎精是構(gòu)成人體和維持生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，腎精主生長發(fā)育、主生殖、生髓、充腦，化生血液（精血互化）[19]，根據(jù)“治未病”的理念，固采用“補(bǔ)腎填精，養(yǎng)心安神”為治療大法的龍膏治療順鉑所致腎損傷，方中鹿角膠益精血補(bǔ)腎陽以填髓，生熟地黃滋腎陰，佐桑椹以補(bǔ)陰血，佐黃柏交通心腎、寧神益智，佐仙靈脾等補(bǔ)益元陽，寓陽生陰長，諳合善補(bǔ)陰者必于陽中求陰，陰得陽生則生化無窮，佐以劉寄奴等活血化瘀、升陽化津，補(bǔ)而不滯，砂仁為使，鼓蕩脾胃之氣，使藥力通行全身，用冰糖者亦有和中緩急、甘溫補(bǔ)中之功，諸藥同用，共奏補(bǔ)腎填精、養(yǎng)心安神之效。本方在治療順鉑所致腎損傷的同時(shí)而不影響順鉑的療效。

順鉑不僅具有腎臟毒性，且可引起消化系統(tǒng)的反應(yīng)而出現(xiàn)食欲下降、惡心、嘔吐等癥狀，通過上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷后的小鼠體重改善不明顯，可能與該藥物無法改善小鼠胃腸道功能有關(guān);腎臟系數(shù)作為評(píng)價(jià)藥物性腎損傷的指標(biāo)之一，有其獨(dú)特的價(jià)值，從上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)龍膏對(duì)各組順鉑所致腎損傷的小鼠模型腎系數(shù)都具有一定的降低作用，提示龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷有改善作用;臨床評(píng)價(jià)腎功能最常用指標(biāo)為血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，這些指標(biāo)的升高提示腎損傷，而龍膏能降低順鉑所致腎損傷的小鼠體內(nèi)血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，再次提示龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷有改善作用;順鉑引起腎損傷的主要靶點(diǎn)為腎小管，使得腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，其具有一定的可逆性，而從上述實(shí)驗(yàn)中可得出龍膏能改善順鉑所引起的腎小管損傷。綜上所述，龍膏對(duì)小鼠順鉑所致的腎損傷具有一定的改善作用。然而，其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期2019-10-13：?編輯：劉斌）