RhD變異型分子生物學(xué)特征及其臨床意義

龐桂芝，臧文正，陳 青，張趁利，婁白敏

(1.新鄉(xiāng)市中心血站血型參比室，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；3.江蘇省血液中心血型研究室，江蘇 南京 210042)

Rh血型系統(tǒng)是人類(lèi)紅細(xì)胞血型中最復(fù)雜的血型系統(tǒng)[1]，主要包括D、E、c、C、e 5種抗原，其中D抗原的免疫原性最強(qiáng)，因其在紅細(xì)胞上質(zhì)或量的變化，可導(dǎo)致弱D、部分D和DEL型等D變異型[2]。部分D主要是由于RHD基因和RHCE基因發(fā)生重組交換，產(chǎn)生融合基因，編碼產(chǎn)生缺乏1個(gè)或多個(gè)抗原表位的D多肽[3]。由于血清學(xué)檢測(cè)方法的局限性，鑒別不同類(lèi)型的弱D或部分D難度較大；而基因分型技術(shù)可彌補(bǔ)血清學(xué)技術(shù)方面的不足，是準(zhǔn)確判定血型的重要手段。Rh血型系統(tǒng)抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，可引起遲發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病等。因此，準(zhǔn)確進(jìn)行RhD血型鑒定對(duì)制定安全有效的臨床輸血策略和對(duì)育齡婦女采取恰當(dāng)措施以預(yù)防新生兒溶血病意義重大。本文結(jié)合RhD變異型的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)分子生物學(xué)試驗(yàn)綜合判定RhD變異型的特征。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇新鄉(xiāng)市中心血站2018年1～2月300例無(wú)償獻(xiàn)血者中進(jìn)行Rh血型鑒定時(shí)初篩RhD陰性，需要進(jìn)一步進(jìn)行RhD陰性確認(rèn)者血樣為研究對(duì)象。

1.2主要試劑與儀器抗球蛋白試劑(批號(hào)：20165002)、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G單克隆抗-D(批號(hào)：20170227)、譜細(xì)胞(批號(hào)：20170720)購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥公司，抗-D(IgM+IgG)(批號(hào)：V171981)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，抗-D(IgM+IgG)(批號(hào)：517060)購(gòu)自南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司，抗-D(IgM+IgG)(批號(hào)：517091)購(gòu)自加拿大Dominion Biologicals Limited公司，Rh血型分型卡(批號(hào)：20170605)、不規(guī)則抗體篩檢卡(批號(hào)：20170605)、抗體篩檢細(xì)胞(批號(hào)：20170802)購(gòu)自長(zhǎng)春博迅生物醫(yī)藥公司，基因組提取試劑盒購(gòu)自北京原平皓公司，脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA酶、MgCl2、5×聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR) Buffer、GoldView核酸染色劑購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Promega公司，特異性引物及內(nèi)參引物參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成；KA-2200離心機(jī)購(gòu)自日本久保田株式會(huì)社，血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)、免疫微柱孵育器購(gòu)自長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司，NanoDrop-2000DNA濃度測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，熒光可見(jiàn)光凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司。

1.3血清學(xué)檢測(cè)采用全自動(dòng)微量板法初篩300例RhD血型，對(duì)于RhD初篩陰性、弱陽(yáng)性的標(biāo)本，再通過(guò)多個(gè)不同廠(chǎng)家(或不同批號(hào))的抗-D試劑進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)；對(duì)于不規(guī)則抗體篩查陽(yáng)性樣本，抗體特異性鑒定采用譜細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.4分子生物學(xué)檢測(cè)從全血中提取DNA，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)序列特異引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)擴(kuò)增RHD基因。通過(guò)凝膠電泳成像系統(tǒng)觀(guān)察PCR產(chǎn)物，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)中均設(shè)立陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照。(1)多重PCR擴(kuò)增RHD基因外顯子7和內(nèi)含子4：PCR反應(yīng)總體積10 μL，含模板DNA 1 μL、內(nèi)參引物0.1 μmol·L-1，dNTPs 0.25 mmol·L-1，特異性引物0.15 μmol·L-1，TaqDNA酶0.4 U，MgCl21.5 mmol·L-1，5×PCR Buffer 2 μL；PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，61 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共22個(gè)循環(huán)。(2)PCR-SSP擴(kuò)增RHD基因啟動(dòng)子和外顯子3、4、5、6、9、10：PCR反應(yīng)總體積10 μL，含模板DNA 1 μL、內(nèi)參引物0.15 μmol·L-1、dNTPs 0.25 mmol·L-1，特異性引物0.2 μmol·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1、Taq DNA酶0.4 U，5×PCR Buffer 2 μL；擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，61 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共22個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1血型血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表1。Rh血型鑒定時(shí)初篩RhD陰性，需要進(jìn)一步進(jìn)行RhD陰性確認(rèn)者血樣本與3種抗-D(IgM+IgG)間接抗人球蛋白試驗(yàn)(indirect antiglobulin test，IAT)中反應(yīng)均為弱陽(yáng)性，鹽水介質(zhì)中與其中2種呈陰性反應(yīng)，1種弱凝集。RhCE表型為ccee。不規(guī)則抗體篩選試驗(yàn)和直接抗人球蛋白試驗(yàn)均為陰性，紅細(xì)胞表面和血清中均未發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體。

表1獻(xiàn)血者紅細(xì)胞與3種抗-D(IgM+IgG)的反應(yīng)結(jié)果

Tab.1Reactionofredbloodcellsfromblooddonorstothreeanti-D(IgM+IgG)

試劑1抗-D(IgM+IgG)鹽水IAT試劑2抗-D(IgM+IgG)鹽水IAT試劑3抗-D(IgM+IgG)鹽水IAT獻(xiàn)血者0+±+0+

2.2RhD陰性無(wú)償獻(xiàn)血者的RHD基因表達(dá)情況PCR-SSP檢測(cè)結(jié)果顯示，RHD基因缺失內(nèi)含子4(226 bp)，表達(dá)外顯子7(123 bp)(圖1)；RHD基因表達(dá)啟動(dòng)子(255 bp)和外顯子10(232 bp)(圖2)，但外顯子3～6表達(dá)缺失，表達(dá)外顯子9(104 bp)(圖3)。即該RhD變異型個(gè)體的基因分型結(jié)果為D3～D6外顯子缺失，表現(xiàn)為RHD-CE(3-6)-D，即D Ⅵc型。

1、2、4：陽(yáng)性對(duì)照；3：外顯子7擴(kuò)增產(chǎn)物；434 bp為內(nèi)參照的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1PCR-SSP檢測(cè)RHD基因內(nèi)含子4和外顯子7的電泳圖

Fig.1Electrophoresisofintron4andexon7ofRHDgenedetectedbymultiplexPCR-SSP

1：RHD基因啟動(dòng)子(255 bp)；2：外顯子10的擴(kuò)增產(chǎn)物(232 bp)；434 bp 為內(nèi)參照的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2PCR-SSP分別檢測(cè)RHD基因外顯子10和啟動(dòng)子的電泳圖

Fig.2Electrophoresisofexon10andpromoterofRHDgenedetectedbyPCR-SSP

1：外顯子3的擴(kuò)增產(chǎn)物；2：外顯子4的擴(kuò)增產(chǎn)物；3：外顯子5的擴(kuò)增產(chǎn)物；4：外顯子6的擴(kuò)增產(chǎn)物；5：外顯子9的擴(kuò)增產(chǎn)物；6：陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3PCR-SSP檢測(cè)RHD基因外顯子3、4、5、6、9的電泳圖

Fig.3Electrophoresisofexon3，4，5，6，9ofRHDgenedetectedbyPCR-SSP

3 討論

人類(lèi)Rh血型系統(tǒng)具有多態(tài)性，臨床重要性?xún)H次于A(yíng)BO血型系統(tǒng)[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)的Rh血型抗原數(shù)目多達(dá)54個(gè)，與臨床最密切的抗原有5種，即D、E、C、c、e[5]。RH基因由位于1號(hào)染色體34.3～36.1短臂上的RHD基因和RHCE基因組成，分別編碼形成D抗原和Cc/Ee抗原。RHD和RHCE基因緊密連鎖，均有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為57 295 bp和57 831 bp，基因編碼蛋白均由417個(gè)氨基酸組成。RHD和RHCE基因結(jié)構(gòu)相似，差異性較大的是外顯子3、4、5、7、9和內(nèi)含子4。由于二者相距很近，方向相反，在遺傳過(guò)程中容易發(fā)生結(jié)構(gòu)互換。若RhD全部丟失，RhD抗原不表達(dá)，為Rh陰性；若RhD部分被RHCE替換，容易形成融合基因，影響RhD抗原的表達(dá)。RhD抗原表型除了D陰性和D陽(yáng)性外，還存在多種D變異型，如弱D、部分D、和DEL型[6]。部分D抗原表達(dá)不完全，主要是由于RHD/CE等位基因轉(zhuǎn)換、多點(diǎn)錯(cuò)義突變和單點(diǎn)錯(cuò)義突變[7]等影響D抗原的表達(dá)。部分D中的DⅥ分為4種類(lèi)型，即DⅥa型：RHD-CE(4-5)-D；DⅥb型：RHD-CE(4-6)-D；DⅥc型：RHD-CE(3-6)-D；DⅥd型：RHD-CE(3-5)-D。DⅥ主要由于RHD/CE/D基因雜交形成，造成紅細(xì)胞表面D抗原表位減少，與大多數(shù)單克隆抗-D抗體弱反應(yīng)或不反應(yīng)[3]，影響Rh血型鑒定。中國(guó)漢族人群中，最常見(jiàn)的部分D變異型是DⅥ型，以DⅥc型最為常見(jiàn)[8-9]，源于RHD外顯子3～6被RHCE基因e等位基因取代，形成了DⅥCe單倍型[10]。

在臨床上，常常因?yàn)镽HD/CE等位基因轉(zhuǎn)換，如單點(diǎn)錯(cuò)義突變和多點(diǎn)錯(cuò)義突變等，引起D抗原表達(dá)異常，干擾Rh血型的鑒定，給輸血安全帶來(lái)隱患。部分D患者若輸入RhD陽(yáng)性的紅細(xì)胞，容易發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生不規(guī)則抗體，影響后續(xù)輸血治療。本研究中，受檢者為RhD變異型，RHD外顯子3～6和內(nèi)含子4缺失，但其啟動(dòng)子、外顯子7、9、10仍存在，說(shuō)明該受檢者的RHD基因外顯子3～6被RHCE基因替換，其基因表現(xiàn)為RHD-CE(3-6)-D，即D Ⅵc型。該基因型影響了紅細(xì)胞膜表面D抗原的表達(dá)，與一種單克隆抗體試劑不反應(yīng)或弱反應(yīng)，必須通過(guò)多種單克隆抗體試劑或多克隆抗體試劑予以驗(yàn)證，或者通過(guò)分子生物學(xué)試驗(yàn)證實(shí)受檢者存在RHD基因。臨床上，在D變異型中，DEL型D抗原表達(dá)最弱，需要通過(guò)更敏感的吸收放散試驗(yàn)才可檢測(cè)出來(lái)。所以，在臨床中應(yīng)重視D變異型個(gè)體的血型檢測(cè)。對(duì)于RhD變異型的個(gè)體，若作為患者，應(yīng)輸RhD陰性血液，以預(yù)防遲發(fā)型輸血反應(yīng)的發(fā)生；若作為獻(xiàn)血者，應(yīng)按RhD陽(yáng)性對(duì)待，避免D陽(yáng)性的紅細(xì)胞進(jìn)入患者體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)抗體。尤其是RhD陰性的育齡婦女，盡可能避免輸注RhD陽(yáng)性血液，避免發(fā)生免疫反應(yīng)，以預(yù)防新生兒溶血病；同時(shí)準(zhǔn)確鑒定RhD血型及基因分型，可為臨床輸血安全提供保障。