嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究進(jìn)展

王雪瑩，石 琳，程 志

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450002)

嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)療法屬于腫瘤免疫療法，其通過提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。2013年《Science》雜志將腫瘤免疫治療評選為“年度十大科學(xué)突破之首”[1]，2015、2016年美國臨床腫瘤學(xué)會年度進(jìn)展報告中將腫瘤免疫治療列為“年度進(jìn)展”[2-3]。近5 a來，CAR-T療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面取得了突出成績，對難治復(fù)發(fā)性急性B淋巴細(xì)胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者治療后的完全緩解(complete response,CR)率高達(dá)90%[4]，對難治復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤患者治療后的總緩解率(overall response rate,ORR)達(dá)85%(該數(shù)據(jù)來源于恒潤達(dá)生在2018年12月美國ASH年會上發(fā)表的報告，試驗注冊號NCT03093168)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，截止2018年5月8日，全球已有550項CAR-T臨床試驗，其中美國212項，中國171項，歐洲89項[5]。但CAR-T治療后的脫靶效應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)等問題仍制約著其療效和安全性。本文就嵌合抗原體(chimeric antigen receptor,CAR)的結(jié)構(gòu)演變及CAR-T的抗腫瘤作用機(jī)制、在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應(yīng)用、目前面臨的問題和解決方案等作一綜述。

1 CAR的結(jié)構(gòu)演變

CAR由胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)與跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域3部分組成[6]，其結(jié)構(gòu)演變經(jīng)歷了一個不斷改進(jìn)、不斷發(fā)展的過程。第1代CAR只有1個胞內(nèi)信號組分CD3ζ或者FcεRIγ分子[7]，只能引起短暫的T細(xì)胞增殖和較少的細(xì)胞因子分泌，體內(nèi)存活時間短，抗腫瘤效應(yīng)弱。第2代CAR在第1代基礎(chǔ)上引入1個共刺激分子信號(如CD28、CD4-1BB等)[8-10]，提高了CAR-T的增殖能力和腫瘤細(xì)胞殺傷能力，延長了其在體內(nèi)的存活時間。大量臨床試驗和動物實驗表明，含有CD28共刺激分子的CAR-T可以維持T細(xì)胞的擴(kuò)增[11-12]。第3代CAR是在原有設(shè)計上串聯(lián)2個免疫共激活信號分子(如4-1BB/CD28與CD3ζ結(jié)合)[13]。第4代CAR在第3代的基礎(chǔ)上增加了編碼CAR及其啟動子的載體[14]。

2 CAR-T的抗腫瘤作用機(jī)制

CAR-T的本質(zhì)是經(jīng)過基因工程技術(shù)修飾的T細(xì)胞，是從患者或供者的外周血中分離出單個核細(xì)胞或CD3+T細(xì)胞，在體外將針對腫瘤特異性抗原的抗原識別區(qū)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因重組，通過慢病毒載體、睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄病毒[15-17]等技術(shù)轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，將經(jīng)過純化、擴(kuò)增的CAR-T回輸至患者體內(nèi)，短時間內(nèi)患者即可獲得自體的、可被腫瘤細(xì)胞激活的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其通過釋放細(xì)胞因子等達(dá)到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的[18]。

正常情況下，T細(xì)胞發(fā)揮免疫功能受到主要組織相容性復(fù)合物( major histocompatibility complex,MHC) 的限制。MHC的限制性是指T細(xì)胞抗原受體識別抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原肽時，必須同時識別抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ分子復(fù)合物，也稱為T細(xì)胞的雙識別[19]。CAR-T細(xì)胞的優(yōu)勢在于它與抗原的結(jié)合不依賴于MHC的遞呈，而是通過單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)直接結(jié)合表面抗原，CAR可以通過CD3ζ和共刺激結(jié)構(gòu)域同時向T細(xì)胞傳遞信號，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的激活[20]。這一方式能有效避免因腫瘤細(xì)胞MHC表達(dá)下調(diào)發(fā)生的免疫逃逸。此外，每個CAR-T能夠殺滅大量腫瘤細(xì)胞[21]，并且可以通過抗原釋放、協(xié)助腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞、延長存續(xù)時間這3種方式加強(qiáng)免疫監(jiān)視，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)[22-23]。

3 CAR-T療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應(yīng)用

3.1CAR-T療法在急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)中的應(yīng)用ALL是一種起源于單個B或T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童，中位發(fā)病年齡為13歲。而成人急性白血病中ALL僅占20%。隨著化學(xué)治療方案的不斷優(yōu)化，現(xiàn)階段兒童ALL的CR率可達(dá)98%，5 a 無病生存 (disease free survival，DFS)率達(dá)80%以上。成人ALL的CR率也可達(dá)80%以上[24]，但其長期生存率較低；兒童患者緩解后易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致其病死率仍較高。

在難治復(fù)發(fā)性B-ALL的治療中，應(yīng)用最多、療效最好的是靶向CD19的CAR-T。CD19是B細(xì)胞表面膜蛋白，廣泛表達(dá)于各個分化階段的B細(xì)胞(正常B細(xì)胞及B細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞)表面，是B細(xì)胞腫瘤的理想靶點[25-26]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，目前已有350例難治復(fù)發(fā)性B-ALL患者在不同中心、不同國家參與回輸不同結(jié)構(gòu)CAR-T的臨床試驗[27]，CR率可達(dá)50%～90%[4]。2016年，美國國家癌癥研究所利用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染以CD28為共刺激因子、以FMC63為scFv的CD19-CAR-T治療5例異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后復(fù)發(fā)的成人B-ALL患者，CR率達(dá)90%(4/5)，CR患者的微小殘留病變(minimal residual disease,MRD)均為陰性[27]。MAUDE等[28]給予75例兒童和年輕成人B-ALL患者輸注Kymriah(諾華批準(zhǔn)上市的CAR-T產(chǎn)品)進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75例患者治療后6個月的無事件生存率和總生存率分別為73%和90%，治療后12個月的無事件生存率和總生存率分別為50%和76%。CHENG等[29]采用第2代CD19-CAR-T治療7例難治復(fù)發(fā)性B細(xì)胞白血病患者，其中5例(71%)達(dá)CR，2例中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(central nervous system leukemia，CNSL)患者表現(xiàn)出持久的CR，持續(xù)時間>15個月。

3.2CAR-T療法在B細(xì)胞淋巴瘤中的應(yīng)用淋巴瘤是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的惡性腫瘤，病理類型十分復(fù)雜，疾病轉(zhuǎn)歸差異極大，目前已知的淋巴瘤有近70種病理類型。淋巴瘤在我國惡性腫瘤中發(fā)病率居第8位。根據(jù)國家癌癥中心2015年數(shù)據(jù)，我國每年新增淋巴瘤患者8.8萬人，每年病死人數(shù)6.8萬人，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)約占45%[30]。

目前，淋巴瘤的治療仍以化學(xué)治療、放射治療和生物免疫治療的綜合治療方式為主，必要時可行造血干細(xì)胞移植。除少數(shù)局限期惰性非霍奇金淋巴瘤可采用局部放射治療外，多數(shù)患者應(yīng)以聯(lián)合化學(xué)治療為主。近年來，以利妥昔單抗(抗CD20單克隆抗體)為代表的免疫治療在B細(xì)胞淋巴瘤中獲得突破性進(jìn)展。CAR-T療法在治療B細(xì)胞淋巴瘤方面也取得了較好療效。2017年10月，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)Kite Pharma公司生產(chǎn)的Yescarta用于治療經(jīng)其他方法治療后無效或既往至少接受過2種方案治療后復(fù)發(fā)的特定類型的成人B細(xì)胞淋巴瘤，包括DLBCL、轉(zhuǎn)化型濾泡性淋巴瘤、原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤。

3.3CAR-T療法在多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)中的應(yīng)用MM是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，由于存在微小殘留病變，在治療過程中無論MM達(dá)到何種程度的緩解，最終均會復(fù)發(fā)。MM是近2 a CAR-T治療的新熱點，常用的靶點有CD138、CD19、B細(xì)胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)等。

BCMA又稱CD269，屬于腫瘤壞死因子超家族，常表達(dá)于MM細(xì)胞、正常漿細(xì)胞及部分B細(xì)胞，免疫組織化學(xué)染色顯示BCMA在MM細(xì)胞上均勻表達(dá)[31]。ALI等[32]采用BCMA-CAR-T治療12例骨髓瘤患者，所有患者在接受該治療前至少接受了3個療程的化學(xué)治療，結(jié)果顯示，1例患者獲得嚴(yán)格意義的完全緩解，持續(xù)17周后復(fù)發(fā)，2例患者達(dá)到非常好的部分緩解，1例患者達(dá)到部分緩解，其余患者均病情穩(wěn)定。河南省中醫(yī)院應(yīng)用BCMA-CAR-T治療11例難治復(fù)發(fā)性MM，其ORR達(dá)90.91%。

4 CAR-T療法面臨的問題及應(yīng)對策略

4.1CAR-T治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應(yīng)及應(yīng)對策略

4.1.1細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokinereleasesyndrome，CRS) CRS是由于CAR-T輸入體內(nèi)后，scFv的特異性抗體識別并結(jié)合腫瘤抗原，激活T細(xì)胞，導(dǎo)致大量炎性因子釋放，同時招募和激活體內(nèi)其他炎性細(xì)胞因子，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，是CAR-T回輸后最常見的不良反應(yīng)，也被認(rèn)為是CAR-T療法在體內(nèi)“發(fā)揮作用”的標(biāo)志，但嚴(yán)重的CRS可導(dǎo)致患者死亡。大多數(shù)患者出現(xiàn)的輕度CRS可通過標(biāo)準(zhǔn)輔助治療，如類固醇、白細(xì)胞介素-6受體拮抗劑妥珠單抗來控制[33-34]。CAR-T回輸前的預(yù)處理化學(xué)治療能降低患者的腫瘤負(fù)荷，也能在一定程度上降低CRS反應(yīng)[34-35]。

4.1.2神經(jīng)毒性CAR-T回輸后的神經(jīng)毒性主要包括意識混亂、失語癥、反應(yīng)遲鈍、肌陣攣、癲癇等，在大多數(shù)患者中是可逆的，但嚴(yán)重時可引起腦水腫，導(dǎo)致患者死亡。2017年3月，Juno公司因臨床試驗中出現(xiàn)多例腦水腫患者死亡而正式宣布放棄CAR-T產(chǎn)品JCAR015的Ⅱ期臨床試驗。但目前在河南中醫(yī)藥大學(xué)血液科參與CAR-T臨床試驗的近70例患者中，尚未觀察到明顯的神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

鑒于CAR-T不良反應(yīng)的不可預(yù)知性，已有研究嘗試在CAR-T中加入“自殺基因”或“分子開關(guān)”來實現(xiàn)細(xì)胞的可控凋亡。2018年第54屆美國臨床腫瘤學(xué)會年會中，上海恒潤達(dá)生生物科技有限公司(自2015年起與河南中醫(yī)藥大學(xué)血液科合作開展CAR-T療法臨床試驗研究)受邀匯報2項最新臨床項目進(jìn)展，其中之一就是帶有安全開關(guān)的以BCMA為靶點治療MM的CAR-T。該公司開發(fā)的是通過γ-反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的活化T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，以表達(dá)具有4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的第2代CAR，以及截短的表皮生長因子受體作為安全開關(guān)的抗BCMA-CAR-T產(chǎn)品。

4.1.3脫靶效應(yīng)理想狀態(tài)下的靶點抗原是僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞及CD34+細(xì)胞不表達(dá)。但實際上很多CAR-T的靶點在正常組織細(xì)胞上也有表達(dá)，這就導(dǎo)致正常細(xì)胞也會受到CAR-T的攻擊而受損傷。為了提高CAR-T的特異性，除了尋找更理想、特異性更高的靶點外，科學(xué)家們也在不斷進(jìn)行新的嘗試。如不斷改進(jìn)CAR-T的結(jié)構(gòu)以提高其作用的精準(zhǔn)性和安全性。改進(jìn)CAR-T結(jié)構(gòu)的方法主要有以下幾種:(1)串聯(lián)型CAR-T。例如CD19和CD22，制備2個CAR用1個T細(xì)胞來表達(dá)。但CD19和CD22的串聯(lián)順序會影響CAR-T的殺傷能力，其療效反而不如CD19-CAR-T[36]。(2)抑制性CAR-T(inhibitory CAR,iCAR)?？墒褂米R別腫瘤相關(guān)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)建CAR，使用識別正常細(xì)胞抗原的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)建iCAR，以降低脫靶效應(yīng)。(3)組合抗原。WILKIE等[37]將2個識別不同抗原的CAR表達(dá)于細(xì)胞表面，每個CAR結(jié)構(gòu)都是不完整的，只有當(dāng)2個抗原同時被識別后才能激活細(xì)胞內(nèi)啟動原件。

4.1.4B細(xì)胞再生障礙ALI等[32]研究發(fā)現(xiàn)了1例MM患者在輸注CAR-T后出現(xiàn)正常漿細(xì)胞缺乏。該研究表明，在某些情況下，免疫球蛋白替代療法(如輸注丙種球蛋白)應(yīng)該用于接受抗BCMA-CAR-T治療的患者。

4.2CAR-T治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤后復(fù)發(fā)的應(yīng)對策略

4.2.1增強(qiáng)CAR-T殺傷力，避免免疫逃逸研究人員研制出一種新型CAR-T，能同時表達(dá)促炎性因子及細(xì)胞因子受體，使CAR-T細(xì)胞既能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制信號，又能通過細(xì)胞因子受體的激活而促進(jìn)CAR-T增殖，這種類型的CAR-T也稱為“裝甲車”。2018年8月，紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的科學(xué)家LIU等[38]將CAR-T和免疫檢查點抑制劑這2種最具潛力的免疫療法結(jié)合在一起，研究出了一種新型CAR-T，其能夠有效對抗實體腫瘤。這種CAR-T能分泌一種迷你版本的免疫檢查點阻斷抗體，該抗體可發(fā)揮類似程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death 1，PD-1)抗體藥物的作用。這種構(gòu)想也可以應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。

除了直接讓CAR-T分泌免疫檢查點阻斷抗體，還可以將CAR-T治療與口服免疫檢查點抑制劑聯(lián)合起來。免疫檢查點是指免疫系統(tǒng)中存在的一些抑制性信號通路。正常情況下，免疫檢查點的調(diào)節(jié)功能可使機(jī)體免受自身免疫攻擊及炎癥損害。細(xì)胞惡變后可通過上調(diào)免疫檢查點的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的殺傷功能，從而逃脫免疫監(jiān)視。免疫檢查點療法是通過阻斷被癌細(xì)胞激活的免疫抑制通路，從而提高T細(xì)胞抗腫瘤的免疫應(yīng)答。近年來，免疫檢查點抑制劑迅速發(fā)展，其中最有名的是2018年在中國上市的PD-1抑制劑納武利尤單抗和帕博利珠單抗。CHONG等[39]報道了1例難治性DLBCL患者經(jīng)CD19-CAR-T治療無效后加用帕博利珠單抗進(jìn)行治療，該患者療效評價為疾病緩解(response disease，RD)，并觀察到加用帕博利珠單抗后CD19-CAR-T的增殖活性得到了大幅度提高。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過反復(fù)多次化學(xué)治療后T細(xì)胞的活性下降，尋找標(biāo)志物來篩選出活性較強(qiáng)的T細(xì)胞有可能會提高CAR-T的殺傷力[40-41]。

4.2.2克服高?；蛲蛔冊谘合到y(tǒng)惡性腫瘤中存在遺傳學(xué)或分子生物學(xué)方面的不良預(yù)后因素，有些具有相對特異性，比如t(4；14)對于MM是不良預(yù)后因素，但對于白血病并非如此；有些具有共性，比如TP53基因突變和復(fù)雜染色體核型在任何一種腫瘤中都是不良預(yù)后因素。臨床中一些藥物也是通過干預(yù)基因突變或融合基因達(dá)到控制甚至治愈疾病的目的。95%的慢性粒細(xì)胞白血病患者存在Ph染色體陽性，Ph染色體指22號染色體長臂與9號染色體發(fā)生易位形成的新染色體，即t(9；22)(q34；q11)。酪氨酸激酶抑制劑的問世使慢性髓樣白血病和ALL患者10 a總體生存率達(dá)80%以上[42-44]。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)，使用該藥治療的慢性粒細(xì)胞白血病患者的骨髓或外周血中融合基因多數(shù)可達(dá)到完全分子學(xué)緩解。治療MM的新藥硼替佐米和來那度胺可以克服t(4；14)帶來的不良預(yù)后，使患者獲益。從這些獲得確切效果的藥物中，或許能得到一些啟發(fā)：能否研制一些新型藥物來糾正染色體或基因突變，以此來預(yù)防疾病復(fù)發(fā)、改善腫瘤類疾病的不良預(yù)后？

4.2.3中醫(yī)藥預(yù)防CAR-T回輸后的復(fù)發(fā)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與體內(nèi)邪氣熾盛產(chǎn)生“邪毒”以及正氣虛弱無力抗邪有關(guān)，正如《內(nèi)經(jīng)·素問》中所說：“邪之所湊，其氣必虛”。中醫(yī)對于腫瘤多采取攻邪、扶正或攻補(bǔ)兼施的治療方法。扶正即通過補(bǔ)氣、養(yǎng)血、溫陽、滋陰等方法提高人體的抗邪能力，預(yù)防疾病發(fā)生或促進(jìn)疾病痊愈。對于CAR-T治療后的腫瘤復(fù)發(fā)，中醫(yī)可著眼于提高T細(xì)胞活力、延長T細(xì)胞在體內(nèi)的存續(xù)時間。目前，尚未見相關(guān)的臨床研究報道，其臨床療效及具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

除此之外，CAR-T療法也可作為難治復(fù)發(fā)性ALL造血干細(xì)胞移植前的橋接治療。對于反復(fù)進(jìn)行化學(xué)治療不緩解的患者，CAR-T回輸后能很快獲得CR(骨髓象及MRD均轉(zhuǎn)為陰性)，從而為造血干細(xì)胞移植創(chuàng)造機(jī)會。CAR-T回輸后的鞏固維持治療是給予小劑量化學(xué)治療還是其他療法，目前尚有待繼續(xù)研究。

CAR-T療法在血液系統(tǒng)腫瘤取得的療效讓人振奮，但仍有很多問題需要解決。CAR-T療法是否有一些遠(yuǎn)期的不良反應(yīng)？患者在接受CAR-T治療達(dá)到CR(或MM達(dá)到PR以上療效)后是否有必要繼續(xù)化學(xué)治療或口服新藥鞏固治療？這些問題都需要通過長期臨床觀察來驗證。