半胱氨酸蛋白酶關(guān)鍵調(diào)控基因在針刺抗腦缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展※

許秀洪 董苗苗 周國平 楊 路 詹珠蓮 羅 夢 江沛聰

（1 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針推康復(fù)科，廣東 廣州 510000；2 佛山市南海區(qū)第六人民醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科，廣東 佛山 528200）

腦血管病以其高發(fā)病率、高致殘率及高病死率成為當(dāng)前威脅人類健康的三大疾病之一，是全球第二大、全國第一大致死性疾病，其高復(fù)發(fā)率、致殘率影響了患者的身體健康及家庭生活質(zhì)量，同樣加重了社會(huì)負(fù)擔(dān)［1-2］。隨著全國老年化的進(jìn)展，缺血性腦梗死也逐年增長［3］。腦血管缺血后供血區(qū)會(huì)出現(xiàn)腦功能障礙，血液供應(yīng)恢復(fù)后，其功能損傷反而更加嚴(yán)重［4］。目前研究較全面的缺血再灌注損傷的主要機(jī)制包括鈣離子的超載、細(xì)胞的凋亡、自由基損傷以及炎癥損傷等［5］。腦缺血再灌注損傷的重要表現(xiàn)形式是細(xì)胞凋亡，作為伴隨炎癥反應(yīng)發(fā)生的細(xì)胞焦亡同樣有重要影響［6］。這兩種細(xì)胞死亡方式主要受到半胱氨酸蛋白酶（Caspase）基因家族關(guān)鍵調(diào)控基因—Caspase-3、Caspase-1 的調(diào)控。

Caspase 是一個(gè)半胱氨酸蛋白酶家族，目前已被發(fā)現(xiàn)的Caspase 共有14 種，具有部分相同的分子結(jié)構(gòu)，有較高的同源性［7］?；谠诩?jí)聯(lián)反應(yīng)中的位點(diǎn)及相應(yīng)的作用，Caspase 家族可分為3 類：第一類是位于凋亡的始動(dòng)位點(diǎn)，活化上游因子并激活下游的Caspase，包括Caspase-2、8、9、10 等；第二類是位于凋亡的效應(yīng)位點(diǎn)，主要分布在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的下游，激活后的半胱氨酸蛋白酶作用于特異性底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，包括Caspase-3、6、7 等；第三類不直接參與細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要參與白介素前體的活化并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，主要包括Caspase-1、4、11、13、14［8］。

1 細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因Caspase-3 與腦缺血再灌注損傷

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過程之一，對組織新陳代謝及免疫等方面具有重要意義和影響［9］。Caspase-3 家族是細(xì)胞凋亡通路中的樞紐位置，其中Caspase-3 是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶［10］。Caspase-3 又稱為CPP32（cysteine protease protein），1994 年，F(xiàn)ernandes-Alnemri T 等［11］發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的凋亡基因編碼的CPP32，相對分子質(zhì)量為32 kDa。Caspase-3 在正常人的大腦神經(jīng)元中表達(dá)甚少，主要以沒有活性的酶原形式存在著［12］。在細(xì)胞凋亡信號(hào)誘導(dǎo)下Caspase-3 會(huì)被激活并發(fā)生裂解，在腦缺血的部位中蛋白表達(dá)出現(xiàn)升高。細(xì)胞凋亡的過程在Caspase 家族級(jí)聯(lián)切割中完成。研究表明，Caspase-3 酶原被不同蛋白水解酶切割并激活［13］，進(jìn)一步作用其他相關(guān)的底物，從而造成細(xì)胞發(fā)生凋亡［14］。腦缺血再灌注損傷后產(chǎn)生大量自由基，通過多種通路誘導(dǎo)激活Caspases-3，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。

目前認(rèn)為，Caspase-3 的激活主要有3 條途徑：線粒體、死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［15］。線粒體通路：細(xì)胞受到各種凋亡信號(hào)刺激后，線粒體膜腫脹，通透性增高，釋放凋亡相關(guān)活性因子細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt C），Cyt C 與凋亡蛋白酶激活因子-1（Aptosis protease-activating factor 1，Apaf l）及Caspase-9 形成凋亡小體，誘導(dǎo)下游Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而完成線粒體途徑的凋亡［16］。死亡受體通路：死亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴死亡配體、受體死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的結(jié)合。其信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要分3 條：TNFR、TRAIL 和Fas/FasL 信號(hào)途徑［17］。各個(gè)途徑均能在凋亡信號(hào)誘導(dǎo)下激活下游Caspase-3 從而引發(fā)細(xì)胞凋亡［18］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑：位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Caspase-12 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子內(nèi)環(huán)境紊亂以及過量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白積累后被激活，活化后作用于Caspase-3，進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡［19］。綜上表明在Caspase 家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)中Caspase-3 是重要的凋亡蛋白酶，位于凋亡的樞紐地位，介導(dǎo)了多種凋亡途徑，所以被稱為“死亡蛋白酶”［20］。由于Caspase-3 在細(xì)胞凋亡中地位的重要，在實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中常常將Caspase-3 作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記［21］。腦缺血再灌注后，大鼠皮質(zhì)和海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞中Caspase-3 mRNA 的表達(dá)會(huì)上調(diào)，并在缺血24 h 上升最高之后逐漸下降，其變化趨勢和細(xì)胞凋亡的變化趨勢相同。應(yīng)用Caspase-3 抑制劑后腦組織Caspase-3 蛋白酶活性及海馬CA1 神經(jīng)元死亡顯著減少［22］。

2 細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵基因Caspase-1 與腦缺血再灌注損傷

在半胱氨酸蛋白酶基因家族中，并不是所有半胱氨酸蛋白酶都參與細(xì)胞凋亡反應(yīng)，還有一類為炎癥相關(guān)半胱氨酸蛋白酶，包括Caspase-1、4、11、13、14 等，主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Caspase-1 不參與凋亡途徑，Caspase-1 基因敲除小鼠凋亡形成不受影響［23］。細(xì)胞焦亡是不同于細(xì)胞凋亡新的細(xì)胞死亡方式，依賴半胱氨酸蛋白酶-1 的介導(dǎo)，參與缺血再灌注損傷中的炎癥發(fā)生［24］。1999 年，Miao EA 等［25］研究發(fā)現(xiàn)沙門桿菌感染的巨噬細(xì)胞存在Caspase-1 介導(dǎo)的程序死亡方式，同時(shí)伴有大量促炎因子的釋放。2001 年，Cooksen 等［26］首次提出焦亡，用來描述炎性細(xì)胞的程序性死亡形式。

研究發(fā)現(xiàn)，不同的刺激信號(hào)可以通過不同的途徑激活Caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞滲透性腫脹，胞內(nèi)物質(zhì)流出，細(xì)胞焦亡是通過炎性細(xì)胞因子白介素-1β 和白介素-18 使得細(xì)胞前體裂解并激活促炎癥性因子的生成導(dǎo)致炎癥反應(yīng)［8］。炎性小體是一種多蛋白質(zhì)復(fù)合物，作為免疫系統(tǒng)的重要部分，能識(shí)別病原體分子信號(hào)導(dǎo)致Caspase-1 的激活，使無活性的白介素-1β、白介素-18 裂解為具活性白介素-1β 和白介素-18，誘導(dǎo)其它炎癥細(xì)胞因子的合成，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞的焦亡［27］。Yamasaki Y 等［28］發(fā)現(xiàn)短暫性腦缺血后大腦中動(dòng)脈和尾殼核的腹側(cè)和腹側(cè)區(qū)腦內(nèi)含水量、壞死和中性粒細(xì)胞浸潤明顯增加。研究人員向側(cè)腦室注射重組人白細(xì)胞介素-1β（rhIL-1β）后增加了腦梗塞的面積，當(dāng)注射抗白介素-1β 后腦組織含水量和腦梗塞面積均減少。李偉等［29］發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后白介素-1β 增加可通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，白細(xì)胞聚集在缺血的腦組織，從而加重腦缺血損害。Caso JR 等［30］發(fā)現(xiàn)大鼠大腦在缺血再灌注后，腦組織中白介素-1β 水平6 h 開始增加，24 h 表達(dá)量最高。Pradillo JM 等［31］發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注后，注射IL-1 受體拮抗劑，大鼠腦梗死的面積較缺血組減小。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血2 h 再灌注損傷24 h 后腦組織白介素-1β 陽性細(xì)胞數(shù)增加，血清白介素-1β 含量上升［32］。也有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注增加激活了Caspase-1、白介素-18 和白介素-1β 的水平［33］。已證實(shí)，在大鼠短暫性腦缺血后，皮質(zhì)及海馬CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元白介素-1β 在缺血3 h 表達(dá)最顯著，且動(dòng)態(tài)變化與腦水腫變化時(shí)間一致。應(yīng)用Caspase-1 抑制劑YVAD-CMK 可顯著減少腦組織白介素-1β 的含量，同時(shí)減輕腦水腫，改善缺血性腦損傷，對局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用［34］。

3 Caspase-3、Caspase-1 在針刺抗腦缺血再灌注中的研究

針刺是治療缺血性中風(fēng)病的有效方法，可激活腦卒中患者的相關(guān)腦區(qū)，調(diào)節(jié)腦血流和相關(guān)分子，調(diào)節(jié)導(dǎo)致炎癥、神經(jīng)元死亡等多個(gè)分子和信號(hào)通路［35］。研究表明，針刺能通過Caspase 基因家族的調(diào)節(jié)減輕腦缺血再灌注損傷，減少腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。

腦缺血再灌注損傷的重要方式是細(xì)胞凋亡，本課題組［36-37］通過線栓法建立MCAO 局灶性腦缺血大鼠模型，1 h 后腦缺血區(qū)已出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，于24 h 達(dá)到高峰，采用電針治療后，缺血后海馬組織細(xì)胞凋亡程度較缺血再灌注組減輕?？族?8］采用免疫組化法和熒光PCR 檢測到針刺結(jié)合康復(fù)療法可以下調(diào)大鼠局灶性腦缺血后Caspase-3 mRNA 和蛋白的表達(dá)，并能減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Xue X 等［39］研究發(fā)現(xiàn)電針可以改善神經(jīng)功能缺損和腦梗死，可抑制缺血半暗帶中的腦細(xì)胞凋亡。同時(shí)，電針可促進(jìn)bcl-2 在mRNA 水平表達(dá)增加，抑制Bax 和裂解的caspase-3 陽性表達(dá)。肖姮等［40］觀察針刺聯(lián)合亞低溫可通過減少腦梗死面積比、提高Bcl-2 表達(dá)、抑制Bax及Caspase-3 蛋白表達(dá)來降低細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到對腦神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)。Li M 等［41］觀察針刺聯(lián)合經(jīng)顱磁刺激，用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測梗死區(qū)Caspase-3 的表達(dá)，結(jié)果Caspase-3 的表達(dá)顯著降低，腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。陳順等［42］觀察到電針干預(yù)腦缺血再灌注大鼠后Bcl-2 的表達(dá)上調(diào)，而Caspase-3 和Bax 的表達(dá)下調(diào)，推測電針可通過調(diào)控Caspase-3，減輕缺血再灌注損傷后的神經(jīng)元凋亡。程瑩瑩等［43］觀察腦缺血再灌注損傷針刺干預(yù)后大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀減輕，其中Caspase-3 和PARP-1 的mRNA 及蛋白表達(dá)下調(diào)，大鼠腦缺血再灌注損傷減輕。Sun Y 等［44］給大鼠顱內(nèi)注射Caspase-3 抑制劑Z-DEVD-FMK 后發(fā)現(xiàn)凋亡指數(shù)和梗死范圍明顯少于腦缺血再灌注大鼠，能有效抑制急性腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，延緩腦組織細(xì)胞壞死，在一定程度上保護(hù)了腦組織功能。

腦缺血再灌注損傷后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致中風(fēng)的重要因素。研究表明針刺對腦缺血再灌注損傷的調(diào)控作用與炎性細(xì)胞因子有關(guān)［45］。張秀婷等［46］發(fā)現(xiàn)針刺可減輕急性腦缺血再灌注后炎癥損傷。黃偉等［47］發(fā)現(xiàn)針刺可以顯著降低腦缺血大鼠海馬區(qū)白介素-1β 的含量，減輕損傷。張亞敏等［48］發(fā)現(xiàn)針刺可抑制腦缺血再灌注各時(shí)期大鼠外周血清炎性細(xì)胞因子白介素-1β、白介素-6 的表達(dá)，減輕炎癥損傷反應(yīng)。Wan F 等［49］發(fā)現(xiàn)針灸通過抑制炎性細(xì)胞因子和黏附分子的產(chǎn)生和表達(dá)，可以有效阻斷炎癥反應(yīng)，對腦缺血引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。Shi P 等［50］發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)電針刺激后能夠抑制過度應(yīng)激，減少炎癥，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，促進(jìn)缺血性中風(fēng)的愈合。Huang J 等［51］發(fā)現(xiàn)電針能有效降低星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增生中的促炎性細(xì)胞因子白介素-1β 水平，改善神經(jīng)功能缺損。針刺可以減輕腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，但關(guān)于腦缺血再灌注損傷后，Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的作用研究尚少。

4 結(jié)語

針刺治療中風(fēng)的機(jī)理一直是針灸界研究的熱點(diǎn)，我們推測，針刺能治療中風(fēng)病，可能是通過某種途徑，發(fā)揮著對腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。為此做了大量的研究，但這些研究，尚不能完全闡明針刺治療缺血性中風(fēng)病的機(jī)理。細(xì)胞凋亡是大腦缺血再灌注后大腦受損的主要形式，細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，目前在大腦的缺血性損傷中研究尚少。而且，目前研究尚未涉及對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡及其關(guān)鍵調(diào)控基因Caspase-3、Caspase-1 的整體研究，對于大腦的缺血再灌注損傷后Caspase 關(guān)鍵基因在細(xì)胞凋亡及焦亡發(fā)展中的作用及其機(jī)制也尚未進(jìn)行深入研究。因此通過研究在腦缺血再灌注損傷中Caspase-3 及Caspase-1 的作用，以期為基礎(chǔ)及臨床上治療腦缺血疾病提供新的研究方向及理論依據(jù)。