不同焦油釋放量卷煙誘導TK基因突變能力的比較研究

尚平平，華辰鳳，謝復煒，李 翔*

（中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州450001）

卷煙煙氣是含有6 000多種化學成分的復雜氣溶膠，其中有69種表現出遺傳毒性[1]，目前，卷煙煙氣的危害評價主要以體外毒性試驗為主。體外毒性試驗具有周期短，靈敏度高等特點，是反映卷煙風險的有力手段，在卷煙煙氣的危害評價中具有重要作用[2]。在進行卷煙煙氣危害評價時，國內外多采用Ames試驗和體外微核試驗來評價其遺傳毒性[3]。近年來，TK基因突變試驗因具有檢測譜較廣、檢出靈敏度較高、簡便易行等特點，得到了較快發(fā)展和不斷完善。歐盟、美國和中國在進行食品添加劑、食品接觸材料用物質、藥品、化妝品等安全性毒理學評價時，也將其作為必選或備選的遺傳毒性試驗方法之一。

吸煙與健康一直是國內外關注的熱點，隨著世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的《煙草控制框架公約》逐漸實施生效，中國煙草在卷煙降焦減害方面開展了大量研究工作[4]，從煙葉原料、卷煙配方、輔助材料和加工工藝等方面降低卷煙煙氣的危害，研制了低焦油卷煙、動植物提取物添加卷煙[5]、減害功能材料添加卷煙等[6]。而如何比較不同卷煙的遺傳毒性強度的差異，國內外均進行了探索性研究[7-9]。

我們將不同焦油釋放量的卷煙，采用標準抽吸條件下收集的卷煙煙氣冷凝物（cigarette smoke condensate，CSC）對L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞進行染毒，計算各卷煙樣品的三氟胸苷抗突變頻率（trifluorothymidine resistance mutation frequency，TMF），利用SPSS 17.0對數據進行線性擬合，初步比較不同卷煙樣品的TK基因致突變能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物及主要試劑 盒標焦油分別為5、8和11 mg的1、2和3號市售卷煙，馬血清（批號1856573）和RPMI 1640培養(yǎng)基（批號1924300）均購自Gibco公司，胸腺嘧啶核苷（批號WXBC1817V）、氨甲碟呤（SLBK2839V）、次黃嘌呤（批號 SLBD4750V）、甘氨酸（批號 BCBM6203V）、三氟胸苷（批號 BCBL1812V）、環(huán)磷酰胺（批號068K1131）均購自Sigma公司，SD大鼠肝S9購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術有限公司（批號S10013）；二甲基亞砜購自上海翊圣生物有限公司（批號D0306）。

1.1.2 細胞株 L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞，由解放軍疾病預防控制所毒理學評價研究中心贈送。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞在37℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度條件下常規(guī)懸浮培養(yǎng)，細胞濃度為1×106/mL，采用含10%馬血清和適量抗菌素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在96孔板上表達培養(yǎng)時采用含20%馬血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2.2 自發(fā)突變清除 為避免細胞的自發(fā)突變對實驗結果產生影響，在正式實驗前，進行自發(fā)突變清除工作。用含3 g/mL胸腺嘧啶核苷、5 g/mL次黃嘌呤、0.1 g/mL氨甲碟呤和7.5 g/mL甘氨酸的THMG培養(yǎng)基處理細胞24 h，800 r/min離心5 min，洗滌后在不含氨甲碟呤的THG培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。

1.2.3 受試物處理 卷煙樣品在（22±2）℃、相對濕度（60±3）%的環(huán)境下平衡48 h后，并在此環(huán)境下采用ISO 4387抽吸方法（抽吸容量35 mL，每次抽吸2 s，每60 s抽吸一次）于轉盤吸煙機抽吸3個卷煙樣品各20支，抽吸結束后，用DMSO以10 mg/mL萃取濾片上的CSC，-80℃保存待用。

1.2.4 染毒 根據細胞毒性的相對存活率確定的試驗劑量分別為20、40、80、100、150μg/mL，取生長良好的L5178Y細胞，調整細胞濃度為5×105/mL，按1%體積加入受試物CSC。陽性對照組加入環(huán)磷酰胺，陰性對照組加入DMSO。37℃振搖處理3 h。800 r/min離心5 min后，棄上清液，用不含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2遍，重懸細胞于含10%馬血清的培養(yǎng)基中。

1.2.5 第0天平板接種效率的測定 按每毫升8個細胞，接種96孔板（每孔加0.2 mL，即平均每孔1.6個細胞），每個劑量作2塊板，37℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)12 d，計數每塊平板有集落生長的孔數，計算第0天平板接種效率（PE0）。

式中EW為無集落生長的孔數，TW為總孔數，1.6為每孔接種細胞數。

1.2.6 表達培養(yǎng)2 d平板接種效率的測定 將細胞懸液調整細胞濃度為2×105/mL，48 h表達培養(yǎng)（每天計數細胞濃度并保持濃度在1×106/mL以下）后，計算相對懸浮生長（RSG）和相對總生長（RTG）。

式中RS2為第2天的相對存活率。

然后按照PE0的方法接種96孔板，培養(yǎng)12 d后，計算PE2，方法同PE0。

1.2.7 TFT抗性突變頻率測定 48 h表達培養(yǎng)結束后，取適量細胞懸液，調整細胞濃度為1×104/mL，加入終濃度為3 g/mL的三氟胸苷，混勻，接種96孔板（每孔加0.2 mL），每個劑量作2塊板培養(yǎng)12 d后，計數有突變集落生長的孔數。

式中EW為無集落生長的孔數，TW為總孔數，n為每孔接種細胞數（2 000），PE2為表達培養(yǎng)2 d的平板效率。

1.2.8 致突變能力比較 當受試物有致突變陽性作用時，將卷煙煙氣各劑量的TMF繪制劑量-反應關系曲線，直線部分的斜率即為致突變強度。直線部分的選擇依據SPSS 17.0統(tǒng)計分析，首先對TMF數據進行一元二次（一元二次方程為y?=a1x2+b1x+c1）線性擬合。二次項系數a1用于評價模型的顯著性，當a1有明顯顯著性時，去掉高劑量數據，剩余數據再進行一元二次線性擬合，直至a1無顯著性。對剩余數據進行一元直線（y?=b2x+c2）回歸模擬，其中，b2為致突變強度[8]。

2 結果

3種卷煙樣品信息及煙氣冷凝物的常規(guī)化學分析數據見表1，實測的焦油含量和煙堿含量與盒標一致或低于盒標。

表1 3種卷煙樣品的信息及煙氣冷凝物的常規(guī)化學分析數據

3種卷煙樣品的煙氣冷凝物TK基因突變試驗結果見表2，陽性對照CP的TMF顯著高于溶劑對照組（P＜0.01）。隨受試物劑量增加，RSG和RTG呈下降趨勢，表現出良好的劑量-反應關系。1號樣品在劑量為150 μg/mL、2號樣品和3號樣品在劑量為100μg/mL時，TMF是溶劑對照組3倍以上，并且隨著CSC劑量的增加，TMF呈上升趨勢。在本試驗條件下，CSC對L5158Y細胞的TK基因有致突變作用。3種卷煙樣品的TK基因致突變強度分別為0.37、0.36和0.38，表明卷煙煙氣的TK基因致突變能力與焦油釋放量無明顯相關關系。

3 討論

卷煙煙氣含有多種遺傳毒性有害成分，如4-（N-甲基-N-亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮、苯并芘等，目前國內外從基因突變[10-11]、染色體和染色體組畸變[12-14]、DNA損傷[15-16]等方面來評價卷煙煙氣的遺傳毒性。國際煙草科學研究合作中心煙草煙氣體外毒性測試工作組推薦采用Ames試驗和體外微核試驗來評價卷煙煙氣的危害，但僅采用這兩種遺傳毒性試驗是不全面的。

表2 卷煙樣品煙氣冷凝物的TK致突變頻率測定結果

國際上至今已發(fā)展了使用不同生物材料的多種類型體內、體外遺傳毒性測試試驗，經濟合作與發(fā)展組織有指導方針的遺傳毒性試驗共15項。這些試驗各具優(yōu)缺點，但尚未發(fā)現單一的一種試驗在檢測終點覆蓋范圍、靈敏度和特異性等方面均能達到令人滿意的程度。因此，國內外均一致認為只有使用一組試驗方法才能對受試物的遺傳毒性作出較為可靠評價。與其他常用的短期致突變試驗相比，TK基因突變試驗檢測的遺傳學終點非常豐富，可檢出的遺傳毒性包括點突變、缺失、置換、基因增殖、雜合等多種遺傳學損傷，這是Ames試驗和體外微核試驗無法比擬的。同時該試驗具有高靈敏度和簡便易行等特點，也是歐盟、美國和中國在藥物、食品安全性評價時的必選或備選遺傳毒性試驗方法。

TK基因突變試驗是Clive和Spector于1975年創(chuàng)建的方法，利用突變細胞對嘧啶類似物表現出抗性而存活的特點對TK突變體進行選擇，從而檢測化學物或其他環(huán)境因素的誘變性[17]。卷煙煙氣在多種遺傳毒性試驗中表現出陽性作用[2]，TK基因突變試驗發(fā)展的完善，使得國際上開始采用TK基因突變試驗來檢測卷煙煙氣的致突變性，美國FDA曾于2011對1種參比卷煙和10種市售卷煙進行小鼠淋巴瘤細胞的TK基因致突變試驗，結果發(fā)現，11種卷煙的煙氣冷凝物均表現出致突變作用，同時發(fā)現致突變強度與焦油釋放量無相關關系[8]。本研究也發(fā)現焦油釋放量的增加，并未直接導致卷煙煙氣致突變能力的增加，這在流行病學的研究中得到了支持，這些研究表明，抽吸中焦油（14.5 mg）、 低 焦 油 （6.5～14.5 mg）和 超 低 焦 油 （＜6.5 mg）[18-19]吸煙者的致肺癌物質的暴露和患肺癌風險無明顯差別，表明卷煙煙氣的遺傳毒性并不單純依賴于焦油量影響。事實上，卷煙煙氣含有100多種有害成分，而焦油中的有害成分可能因煙草特性、卷煙的物理及化學特征及吸煙行為而異（即吸煙者的抽吸次數、抽吸體積及抽吸持續(xù)時間等）[20]。

總之，本研究表明，小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗可以評估卷煙煙氣的遺傳毒性，同時，卷煙煙氣對TK基因的致突變能力與焦油釋放量無明顯相關關系。