紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備與質(zhì)量評價研究

史 凡, 楊 紅

(首都醫(yī)科大學(xué) 燕京醫(yī)學(xué)院, 北京 100069)

紫草素(Shikonin,SN)是從傳統(tǒng)中藥紫草中提取的一類萘醌類化合物,具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用、抗病毒和抗菌作用、抗腫瘤、抑制脂肪生成等作用[1-2],其廣泛的藥理與臨床作用日益受到人們的重視。目前,國內(nèi)外對紫草中化學(xué)成分、藥理作用、提取工藝的研究較全面和深入[3-4],對紫草素在動物體內(nèi)的吸收特性也有了一定研究[5-6]。而針對制劑方面的研究還不夠完善,僅有脂質(zhì)體、微乳等方面的初步研究報道[7-8]。臨床應(yīng)用的制劑通常存在釋藥不規(guī)則、質(zhì)量不穩(wěn)定等諸多不足,尚不足以解決紫草素在水溶液中溶解度極低,毒性大且缺乏選擇性[9]的問題。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers, NLC)是在固體脂質(zhì)納米粒的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的藥物納米載體,是由幾種不同結(jié)構(gòu)、互不混溶的固液脂質(zhì)構(gòu)成的一種具有特殊結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)填充體系[10-11]。目前國內(nèi)外對納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的研究技術(shù)較為成熟[12-13],已充分證實可提高難溶性藥物的溶解度,促進藥物的充分溶解[14],促進藥物在胃腸道的吸收[15]。目前專門針對紫草素的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備研究尚未開展。本實驗擬設(shè)計制備載有紫草素的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(SN-NLC),對其理化性質(zhì)與體外釋放進行測定及評價,為后期的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

儀器:高壓乳勻機(GEA, Niro Soavi S.P.A., Italy),透射電子顯微鏡(JEM-1230, JEOL, Japan),紫外可見分光光度儀(UV-762上海精密科學(xué)儀器有限公司),分析天平(BS124S Sartoriusd=0.0001),恒溫磁力攪拌器(S21-2 上海司樂儀器有限公司),激光納米粒度儀(BROOKHABEN Instruments Corporation),KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),振蕩搖床(Forma Orbital Shaker,Thermo),透析袋(Solarbio,Mw=7000)等。

材料:紫草素(中國食品藥品檢定研究所),單硬脂酸甘油酯、中碳鏈三甘酯(天津市光復(fù)精細化工研究所),吐溫-80(中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司),各種無機鹽和有機溶劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體由高壓乳勻法制備。首先稱取處方量的固相脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯和液相脂質(zhì)中碳鏈三甘酯于茄形瓶中,水浴加熱,待固液相脂質(zhì)熔融后,攪拌下滴加入紫草素的乙醇溶液；同時稱取處方量的吐溫-80攪拌分散于磷酸鹽(pH7.4)緩沖溶液中,攪拌下,滴入熔融的固液脂質(zhì)中,繼續(xù)攪拌制得預(yù)乳化液；同溫(1.0～1.2)×108Pa下采用高壓乳勻機循環(huán)乳勻5次,室溫冷卻后得到紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

2.2 粒徑分布、Zeta電位測定方法及形態(tài)學(xué)觀察

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布和Zeta電位由激光納米粒度分析儀測量,其中粒徑采用強度分布(Intensity distribution)的結(jié)果,多分散性指數(shù)(Polydispersity Index, PI)采用單峰分布(unimodal distribution) 的結(jié)果。粒徑和Zeta電位均測定3次,取平均值。

采用透射電鏡觀察納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的微觀形態(tài)。取樣品溶液,用蒸餾水稀釋,取10 μL置于銅網(wǎng)表面,下襯濾紙,空氣中自然揮干后,于電鏡下觀察。固定電鏡電子束電壓為80 kV,移動坐標,調(diào)節(jié)放大倍數(shù),尋找觀察粒子并拍照。

2.3 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中紫草素的測定

2.3.1 檢測波長的選擇

精密移取紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體供試液,空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體供試液以及紫草素對照品適量,用甲醇稀釋后,在200～800 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中紫草素與紫草素對照品在516 nm波長處均有最大吸收峰,而空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在此波長處無吸收,對測定無干擾。因此選定516 nm作為測定藥物含量的波長。

2.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取紫草素標準品適量,用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0mg/L溶液,以甲醇為空白對照,在516 nm處測定其吸收度A。得到標準曲線方程為A=0.016 8C+0.016 1(R=0.999 8),C紫草素質(zhì)量濃度。表明紫草素對照品在0.5～40.0 mg/L濃度范圍內(nèi),與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度與回收率實驗

取上述紫草素對照品溶液0.5、10、40 mg/L(低、中、高)3個質(zhì)量濃度,早、中、晚重復(fù)測定3次,連續(xù)測定3 d,計算得日內(nèi)RSD分別為1.07%、0.59%、0.67%；日間RSD分別為1.44%、0.86%、1.28%,表明日內(nèi)、日間精密度較好。

制備空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體,分別量取空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體 100 μL,分別加入0.5 g/L 的紫草素母液,用甲醇逐級稀釋定容至10 mL棕色容量瓶中配制成0.5、10、40 mg/L(低、中、高)3個質(zhì)量濃度的溶液,早、中、晚重復(fù)測定3次,按標準曲線計算回收率。結(jié)果表明,低、中、高3個質(zhì)量濃度的紫草素回收率分別為99.2%(RSD=0.73%)、100.13%(RSD=0.66%)、98.73%(RSD=1.17%),表明回收率良好,空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體即輔料對測定結(jié)果無干擾。

2.3.4 包封率的測定

精密吸取紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體供試液1.0 mL,上樣經(jīng)處理的葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50柱(長度20 cm,內(nèi)徑1 cm),用磷酸鹽(pH7.4)緩沖液洗脫,流速1 mL/min,收集樣品,每管2.0 mL,將上述各管收集液分別置10 mL容量瓶,用甲醇定容；超聲2 min,搖勻；設(shè)置波長516 nm測定藥物含量,考察流出曲線,計算包封率。

2.4 采用正交試驗設(shè)計法優(yōu)化處方

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上,選擇對紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體影響較大的3個因素,即固相脂質(zhì)與液相脂質(zhì)重量的比值(E)、藥物與總脂質(zhì)重量的比值(F)、乳化劑的質(zhì)量分數(shù)(G),采用正交試驗設(shè)計法,按照L9(33)正交表設(shè)計成3因素3水平的正交試驗,以粒徑和包封率為參考指標對處方進行進一步篩選,詳見表1。

表1 紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的正交試驗設(shè)計表

2.5 體外釋放度考察

采用動態(tài)透析法,精密移取紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體2 mL于已活化好的透析袋中,兩端用透析夾加緊,置于裝有40 mL溶出介質(zhì)(pH7.4)的具塞錐形瓶中；放入37 ℃空氣恒溫振蕩器中,100次/min振蕩,于1、2、4 、8 、12、24、48、72 h取樣,并更換新鮮透析介質(zhì)。取出的樣品在波長516 nm處測定藥物含量。同時以游離藥物紫草素的釋放作對照。根據(jù)公式計算各時間點相對累積釋放率(相對累積釋放率=某個時間點取樣測定的總量/72 h的最終釋放量),繪制釋放曲線。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗設(shè)計法優(yōu)化處方結(jié)果

按L9(33)正交表設(shè)計成3因素3水平的正交試驗,以粒徑(PS)、包封率(EE)為參考指標對處方進一步篩選,試驗結(jié)果見表2?？傻米顑?yōu)處方為A2B3C3,即固相脂質(zhì)與液相脂質(zhì)重量的比值為1∶1,藥物與總脂質(zhì)重量的比值為1∶25,乳化劑的重量百分比為1.5%。

表2 紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的正交試驗設(shè)計結(jié)果及分析

3.2 粒徑分布、Zeta電位、包封率及形態(tài)學(xué)觀察

取由優(yōu)化處方制備的紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體樣品溶液,蒸餾水稀釋100倍后,用激光納米粒度分析儀測量粒徑分布和Zeta電位,粒徑結(jié)果為(209.7±3.4) nm,Zeta電位為(-34.57±1.53) mV,Zeta電位結(jié)果表明制備的紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體體系的穩(wěn)定性良好。采用葡聚糖凝膠G50柱分離,紫外分光光度法測定紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的包封率為(91.66±3.08)% 。

觀察紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體樣品溶液的外觀均一穩(wěn)定,無沉淀,具有紫紅色乳光(圖1(a))。透射電鏡下觀察為圓形小球,分散均勻,形狀規(guī)整,大小在200 nm左右(圖1(b))。與激光納米粒度儀測定結(jié)果相吻合。

圖1 紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的外觀形態(tài)與透射電鏡結(jié)果

3.3 體外釋放結(jié)果

紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外累積釋放曲線見圖2(R為累積釋放率)。由圖可得,游離藥紫草素在12 h累計釋放量已達到(92.06±1.56)%,紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在12 h內(nèi)累計釋放僅達到(66.40±1.12)%,72 h后達到(89.75±0.91)%。進一步觀察釋放曲線,與游離藥紫草素相比,紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體表現(xiàn)出明顯的緩釋行為,呈現(xiàn)先突釋,后緩釋的效果。

圖2 紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外累積釋放曲線

對紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體累積釋放率R與時間t按照零級、一級、Higuchi、Weibull和Korsmeyer-Peppas方程進行擬合,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,以Weibull方程擬合的相關(guān)系數(shù)最大,說明該方程能較好地描述紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外釋藥特征。

表3 紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的釋放曲線擬合結(jié)果

4 討論

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體采用混合脂質(zhì)為載體,將常溫下為液態(tài)的脂質(zhì)加入到固態(tài)脂質(zhì)中,使晶體混亂度增加,承載藥物空間增大,是特殊骨架材料的納米粒,能夠保護藥物免受降解,提高穩(wěn)定性,改善藥物的藥理學(xué)與藥代學(xué)性質(zhì),目前已成為國內(nèi)外新劑型研究熱點[16]。本實驗采用高壓乳勻法制備,正交試驗設(shè)計法篩選出最優(yōu)處方,得到的紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體外觀圓整,粒徑分布均勻,體系穩(wěn)定,優(yōu)化的制備條件重復(fù)性較好。

體外釋放實驗中紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體呈現(xiàn)先突釋、后緩釋的效果,分析原因可能由于藥物分子一部分吸附或嵌在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體表面,另一部分鑲嵌在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的骨架中或被包裹在其內(nèi)部。吸附在表面或表層的藥物快速釋放,構(gòu)成釋放曲線初始階段的突釋結(jié)果,之后被包裹的藥物從納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體骨架中擴散出再釋放,構(gòu)成釋放曲線后段的緩釋結(jié)果。說明納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體以先快后慢的方式釋放紫草素,推測在體內(nèi)先釋放的藥物可迅速起效,后緩釋釋放的藥物可以持續(xù)作用,獲得更好的治療效果。后續(xù)實驗將對紫草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)運吸收特性做更深入的研究,以期為高效低毒、穩(wěn)定安全的藥物新劑型研究提供科學(xué)依據(jù)。