聚甲基丙烯酸甲酯與磷酸鈣和慶大霉素復(fù)合型骨水泥的生物力學(xué)研究

項明源，李超，王學(xué)輝，成艷琪，張濤，李朝陽*

(1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300192；2.天津大學(xué)，天津 300192；3.天津市第一中心醫(yī)院骨科，天津 300192)

骨質(zhì)疏松癥是多種原因引起的一組骨病，是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點的代謝性骨病變，由于骨組織數(shù)量的減少和骨組織結(jié)構(gòu)的變化可導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降[1]，在受到輕微沖擊時易發(fā)生骨折。其中以椎體骨質(zhì)疏松性壓縮骨折較為常見，在瑞典每3名70～79歲的女性中有1位被發(fā)現(xiàn)患有骨質(zhì)疏松癥，且每年要花費約為35億瑞典克朗來治療其導(dǎo)致的骨折。近幾年隨著中國老齡化加重，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率正逐年增加[2-3]，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率也在逐年增加，成為了骨科常見的疾病，給患者帶來極大的痛苦，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。所以骨質(zhì)疏松性骨折越來越受到人們的重視。但是傳統(tǒng)的手術(shù)治療骨質(zhì)疏松性骨折具有創(chuàng)傷大、花費高、住院時間長、療效差等缺點，越來越難以為人們所接受。經(jīng)皮椎體成形術(shù)(percutaneousvertebroplasty，PVP)是通過穿刺向患椎內(nèi)注入骨水泥來治療疾病[4]，最早產(chǎn)生于1987年，并于1993第一次用于治療骨質(zhì)疏松性壓縮性骨折，取得了較滿意的成效。經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)(percutaneous kyphoplasty，PKP)是在PVP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可降低骨水泥的泄漏率。這兩種微創(chuàng)手術(shù)都可增強(qiáng)患椎的穩(wěn)定性、部分或大部分恢復(fù)患椎的高度來治療骨折，且創(chuàng)傷小，恢復(fù)快，術(shù)后疼痛減輕明顯，極大地提高患者的生活質(zhì)量，成為目前臨床上治療老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折(osteoporotic vertebral compression fractures，OVCFs)的常用方法[5-8]。

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)因其具有良好的力學(xué)性能，仍然是臨床上常用的骨水泥[9-10]。骨水泥外溢是椎體成形術(shù)后最常見的并發(fā)癥，但PMMA術(shù)后始終不能降解，滲漏到椎間盤的骨水泥可以導(dǎo)致椎間盤持久性高應(yīng)力和細(xì)胞滲透功能減退，加速椎間盤退變，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤吸收負(fù)荷分散應(yīng)力的作用減弱，加之術(shù)后病椎的硬度會高于相鄰椎體，導(dǎo)致相鄰椎體的應(yīng)變和應(yīng)力增加，兩者都可增加相鄰椎體骨折的風(fēng)險[11]。而且PMMA聚合時釋放大量的熱量，局部溫度可達(dá)130℃左右[12-13]，可致其周圍的組織細(xì)胞死亡，加上其還可引起過敏、局部組織抗感染能力降低、致癌等一系列不良反應(yīng)，這就限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，新型骨水泥的研發(fā)成為了研究的熱點，隨后大量的新型骨水泥先后出現(xiàn)，其中磷酸三鈣骨水泥β-磷酸三鈣(β-Tricalcium phosphate，β-TCP)在生理條件下能自固化，如在溫度(37℃)、濕度(100%)條件下發(fā)生水化反應(yīng)得到與人體骨組織相近的固化產(chǎn)物-羥基磷灰石或透鈣磷灰石，因其具有良好的可降解性[14]、骨傳導(dǎo)性、可吸收性、生物相容性、反應(yīng)不產(chǎn)熱、無毒性、可操作性好、可用于注射[15]，成為人們研究的熱點。

感染是外科常見的疾病，但是對于骨科醫(yī)生感染是非常棘手的，特別是需要在關(guān)節(jié)及椎體部位植入異體骨材料及骨代替物的手術(shù)，因為感染后容易在植入物形成一層生物膜[16-17]，導(dǎo)致抗生素?zé)o法到達(dá)感染部位，且一般在植入物移除以前生物膜難以清除，導(dǎo)致治療效果不理想，甚至導(dǎo)致感染暴富。在美國每年需要花費超過2億美元來治療此類感染[18]，所以預(yù)防此類感染的發(fā)生越來越受到人們的重視，隨后人們開始研究在植入物表面及/或內(nèi)部加入抗菌劑。大量帶有抗生素的骨材料先后出現(xiàn)。慶大霉素(gentamicin，GM)屬于氨基糖苷類抗生素，能與細(xì)菌核糖體30 s亞基結(jié)合，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，慶大霉素是為數(shù)不多的熱穩(wěn)定性的抗生素，具有廣譜的抗菌譜[19]，具有良好的療效，且其價格低廉從而廣泛應(yīng)用于臨床。

因此本課題旨在找到一種良好的骨代替材料，具有良好的力學(xué)性能、生物相容性、可降解性、抗菌性等。我們選擇了PMMA、β-TCP和GM組成復(fù)合骨水泥，希望能將其各自的良好性能組合在一起。即復(fù)合材料具有PMMA良好的力學(xué)性能可以支撐病椎，治療并防止其進(jìn)一步塌陷；具有β-TCP良好的降解性，可以在人體中無毒性降解并形成和松質(zhì)骨類似的結(jié)構(gòu)，具有良好的空隙結(jié)構(gòu)，可以讓新生骨長入其中；有GM良好的抗菌性，可以殺滅致病菌，防止生物膜形成。

1 材料

1.1 實驗儀器和設(shè)備 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；pH計(計梅特勒托利多公司)；WDW-20微控電子萬能實驗機(jī)(長春科新儀器有限公司)；紫外線光譜儀UV-2700(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；一次性使用無菌注射器(江西豐臨醫(yī)用器械有限公司)；聚丙烯離心管(上?？七M(jìn)醫(yī)療器材有限公司)；移液器(德國艾本德股份公司)；恒溫恒濕振蕩器(納諾斯克(天津)科技有限公司)。

1.2 實驗試劑和材料 聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥液體單體、β-磷酸鈣骨水泥粉末、慶大霉素粉末。

2 方法

2.1 復(fù)合型骨水泥(PMMA/β-TCP/GM)的制備和分組 將β-TCP粉末按15%、25%、35%的總質(zhì)量比分別與對應(yīng)的PMMA粉末混合，將GM粉末按4%的總質(zhì)量比分別加入到上述三組中，充分混合后裝瓶保存，并依次編號為a、b、c組。

2.2 復(fù)合型骨水泥(PMMA/β-TCP/GM)性能的測驗

2.2.1 骨水泥可注射時間檢測 取一組復(fù)合骨水泥，用電子天平稱取10 g，將其放入燒杯中，準(zhǔn)備好計時器、固化液，按廠家推薦的固液比(2︰1)將5 mL固化液加入到復(fù)合骨水泥中，并開始計時，攪拌30～60 s。將攪拌好的骨水泥加入到10 mL的無菌注射器內(nèi)，每隔5 s推一下注射器，直到推注射器時骨水泥不能流出為止，立即停止計時即為可注射時間，用同樣的方法測定另外兩組可注射時間。

2.2.2 浸泡前抗壓實驗檢測 將a、b、c組骨水泥在常溫下，按廠家推薦的固液比混合調(diào)和均勻后，加入到模具后制成圓柱體(直徑6 mm，高12 mm)。將制好的不同組式樣分組保存，干燥后用WDW-20微控電子萬能實驗機(jī)測試抗壓強(qiáng)度(每組數(shù)據(jù)至少做6個平行實驗)。

2.2.3 浸泡后體外降解率檢測 將a、b、c組骨水泥在常溫下，按廠家推薦的固液比混合調(diào)和均勻后，加入到模具后制成圓柱體(直徑6 mm，高12 mm)。將制好的a、b、c組式樣分別分成7組，每一組6個，并依此編號為a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7組；b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7組；c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7組。將各組的式樣干燥至恒重后稱重，將各組式樣按1個比5 mL的比例浸泡于盛有30 mL磷酸鹽緩沖生理鹽水聚丙烯的離心管中并注明對應(yīng)的編號，放在搖床上搖晃，溫度恒定在37℃、濕度：24%、轉(zhuǎn)速：100 rpm。分別于1 d、3 d、5 d、1周、2周、3周、4周分別取出各組編號為a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7組；b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7組；c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7組樣本，取出后干燥至恒重后稱重保存待用，浸泡液同樣保存待用，用浸泡前后重量差計算降解率，降解率=(浸泡前重量-浸泡后重量)/浸泡前重量。

2.2.4 浸泡后抗壓的檢測 用WDW-20微控電子萬能實驗機(jī)測試浸泡干燥后樣本抗壓強(qiáng)度(每組數(shù)據(jù)至少做6個平行實驗)，記錄并比較浸泡前后抗壓強(qiáng)度。

2.2.5 浸泡后浸泡液pH值檢測 用pH計分別于1 d、3 d、5 d、1周、2周、3周、4周測量各組浸泡液的pH值，并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.6 用紫外分光儀測量浸泡液中GM量，計算樣本的體外釋放

2.2.6.1 紫外光譜 取一組浸泡液在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明在281 nm時吸收峰最大。

圖1 200～400 nm波長范圍內(nèi)慶大霉素的紫外線吸收值

2.2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取慶大霉素適量，精確稱量，加水制成每1 mL水中含慶大霉素4 mg的溶液，加水精確稀釋0.1、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在200～400 nm內(nèi)掃描，取其在281 nm處的最大值，記錄并計算標(biāo)準(zhǔn)線方程。

2.2.6.3 測量并計算各組GM的濃度 用紫外分光儀測量各組的GM紫外線吸收值，取其在281 nm處的最大值，根據(jù)紫外線標(biāo)準(zhǔn)線計算其濃度，并記錄。

3 結(jié) 果

3.1 骨水泥的可注射時間 a組的可注射時間為(500.33±3.14)s，b組的可注射時間為(530.17±2.31)s，c組的可注射時間為(564.83±2.14)s。a、b、c三組可注射時間的組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。隨著β-TCP含量的增高，PMMA含量的降低，可注射時間逐漸增加。

3.2 浸泡前抗壓結(jié)果 a組的浸泡前抗壓強(qiáng)度為(66.52±2.61)MPa，b組的浸泡前抗壓強(qiáng)度為(70.51±2.64)MPa，c組的浸泡前抗壓強(qiáng)度為(74.92±0.92)MPa。a、b、c三組的抗壓強(qiáng)度組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.3 浸泡后體外降解、體外慶大霉素釋放、浸泡液pH、浸泡后抗壓的檢測結(jié)果

3.3.1 體外降解結(jié)果 a、b、c三組復(fù)合骨水泥抗壓強(qiáng)度的組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而且復(fù)合骨水泥的體外降解率在一定范圍內(nèi)隨著浸泡時間的增加而增加，并隨著β-TCP含量的增加而增加(見表1)。

3.3.2 浸泡后抗壓結(jié)果 a、b、c三組抗壓強(qiáng)度的組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且隨著浸泡時間的增加骨水泥的抗壓強(qiáng)度減小(見表2)。

3.3.3 浸泡液pH值 a、b、c三組復(fù)合骨水泥浸泡液pH值的組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而且復(fù)合骨水泥浸泡液的pH值在一定范圍內(nèi)隨著浸泡時間的增加而減小，并隨著β-TCP含量的增加而減小(見表3)。

3.3.4 用紫外分光儀測量浸泡液中GM量

3.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 慶大霉素在0.1、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在281 nm吸收值分別是0.067、0.133、0.170、0.206、0.242、0.277、0.312、0.347，結(jié)果表明慶大霉素在0.1～4.0 mg/mL范圍內(nèi)與其吸收值成良好的線性關(guān)系，符合比爾定律，其回歸方程為C=13.935A-0.855 2；r=0.999 9。

3.3.4.2 浸泡液慶大霉素值的測量 取每組浸泡液在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，取其在281 nm處的最大吸收值。再根據(jù)回歸方程計算出其濃度。結(jié)果如下：a、b、c三組復(fù)合骨水泥浸泡液中慶大霉素累計釋放量的組間比較有明顯差異性(n=3，P<0.001)，而且復(fù)合骨水泥浸泡液中慶大霉素累計釋放量在一定范圍內(nèi)隨著浸泡時間的增加而增加，并隨著β-TCP含量的增加而增加(見表4)。

4 討 論

隨著臨床上椎體成形術(shù)的增加，人們對骨水泥的研究也越來越多，也越來越重視，可見一種理想的骨水泥對疾病的治療是極其重要的。一種理想的骨水泥首先需要具備以下特性[20]：a)良好的抗壓強(qiáng)度；b)良好的生物相容性；c)良好的骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性、成骨性；d)良好的可塑性、可操作性；e)良好的可降解性；f)不影響修復(fù)部位微環(huán)境等。但是到目前為止還沒有令人非常滿意的骨水泥，且每種骨水泥都其各自的特點，本實驗的目的就是將不同骨水泥的優(yōu)點結(jié)合在一起，制成令人更加滿意的復(fù)合骨水泥。

可注射時間是骨水泥可操作性的一種表現(xiàn)，一個良好的可注射時間，可以增加手術(shù)成功率。以前研究發(fā)現(xiàn)純PMMA的固化時間約在111s左右，嚴(yán)重限制其在臨床上的應(yīng)用[21]，本實驗研究發(fā)現(xiàn)隨著β-TCP含量的增高，復(fù)合骨水泥的可注射時間增加，當(dāng)β-TCP含量達(dá)35%時可注射時間可達(dá)564 s左右，是一個較為理想的可注射時間。

表1 三組不同時間骨水泥體外降解率比較

表2 三組不同時間骨水泥浸泡后的抗壓強(qiáng)度比較

表3 三組不同時間骨水泥浸泡液的pH值比較

表4 骨水泥體外慶大霉素的釋放量

本實驗測量的抗壓強(qiáng)度是指骨水泥開始發(fā)生形變時的所能承受的增大強(qiáng)度，因為在臨床上如果注入的骨水泥固化后發(fā)生形變可能會影響其穩(wěn)定性，可導(dǎo)致手術(shù)失敗甚至加重病情。尚希福等發(fā)現(xiàn)純PMMA的抗壓強(qiáng)度約在95 MPa左右[22]，本實驗研究示復(fù)合型骨水泥在浸泡前隨著β-TCP含量的增高，其抗壓的強(qiáng)度也隨著增高，當(dāng)β-TCP含量在35%時，抗壓的強(qiáng)度可達(dá)75 MPa左右，雖然較純的PMMA降低，但仍可以滿足臨床上治療椎體壓縮性骨折的需要。浸泡后骨水泥的強(qiáng)度逐漸降低，但是一直在臨床上需要的強(qiáng)度范圍內(nèi)。

現(xiàn)在臨床上常用的骨水泥沒有可降解性，術(shù)后存在很多問題，本實驗通過將β-TCP加入到PMMA中來增加其可降解性。復(fù)合骨水泥的降解速率是其可用于骨折治療的重要指標(biāo)，其降解的過快或過慢都會影響骨折愈合。本實驗研究示隨著β-TCP含量的增加，其降解的速率隨之增加，當(dāng)β-TCP含量達(dá)35%時，骨水泥的4周可降解率可達(dá)11%左右，但其是否可以為新骨形成提供良好的微環(huán)境，是否可以形成與松質(zhì)骨類似的結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步研究。

人體是在一個恒定的pH值范圍內(nèi)，pH值過高或者過低都可能會影響骨折的愈合。本實驗顯示pH值隨著浸泡時間的增加，浸泡液的pH值隨之降低，且β-TCP含量高的一組Ph值降低高于β-TCP含量的組，當(dāng)β-TCP含量達(dá)35%時，浸泡4周后pH值達(dá)6.4左右，仍在可以接受的范圍內(nèi)，但是否影響骨折處新生骨的形成還需要進(jìn)一步研究。

骨水泥作為抗生素的載體是治療和預(yù)防感染的良好方法，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，預(yù)防疾病比治療疾病更加重要，預(yù)防感染也是骨科非常重視的。因純PPMA始終不能降解，所以不能滿足成為抗生素載體的要求，而本實驗加入β-TCP后，復(fù)合骨水泥具備成為抗生素載體的要求。本實驗結(jié)果顯示，隨著TCP含量的增加，慶大霉素的釋放量隨之增加，且是緩慢長期的釋放，不再像過去研究的那種驟然短期的釋放，可以更加有效的治療和預(yù)防感染。

根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，我們得出β-TCP在占35%質(zhì)量比時，具有良好的可注射時間、抗壓強(qiáng)度、pH值和良好的慶大霉素釋放量和釋放速度，最符合我們實驗的目標(biāo)。但是復(fù)合骨水泥浸泡后的表面及內(nèi)部形貌、在動物體內(nèi)的相容性、安全性、成骨性、抗壓強(qiáng)度、降解速率、藥物的釋放量和速度、治療感染的臨床效果等還需要進(jìn)一步研究。