哺乳動物單細(xì)胞研究技術(shù)的現(xiàn)狀與未來

姜文倩，田亞茸，左銳，林峻

1 福州大學(xué) 應(yīng)用基因組學(xué)研究所，福建 福州 350108

2 哥德堡大學(xué) 生物醫(yī)藥研究所感染性疾病中心，瑞典 哥德堡 40530

3 福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122

4 福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108

細(xì)胞是生命的基本單位，大多數(shù)生命體都是多細(xì)胞生物。過去，由于技術(shù)的限制，研究者對細(xì)胞的研究僅處于多細(xì)胞層面。多細(xì)胞研究假設(shè)培養(yǎng)皿中所有的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中都相同，科學(xué)家們只是在放大信號。但這并不總是正確的，分子水平上的細(xì)微差別可能導(dǎo)致細(xì)胞行為的顯著變化。

近年來，基于對多細(xì)胞DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的研究，科學(xué)家們對各種物種有了深刻的了解。但研究多細(xì)胞對理解細(xì)胞的多樣性存在一定的局限性。每個細(xì)胞都是獨(dú)一無二的，不僅腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性，人體正常細(xì)胞間也存在異質(zhì)性[1-4]，甚至在同一個體中，不同單細(xì)胞都有其獨(dú)特的基因組。多細(xì)胞研究的結(jié)果僅體現(xiàn)出這些多細(xì)胞的總體情況，而不能體現(xiàn)單個細(xì)胞之間的差異。單個體細(xì)胞基因組的變異，諸如單核苷酸變異(SNVs)、拷貝數(shù)變異 (CNVs) 和結(jié)構(gòu)變異，可能導(dǎo)致癌癥及其他疾病的產(chǎn)生[5-7]。

為了打破多細(xì)胞研究的局限性，人們越來越關(guān)注單細(xì)胞研究。單細(xì)胞研究有助于我們研究癌癥等相關(guān)疾病。無論是增殖或休眠的腫瘤組織，單個細(xì)胞都是支配癌癥生物學(xué)各方面的決定因素[8]。對腫瘤組織單細(xì)胞水平的分析能了解腫瘤內(nèi)遺傳異質(zhì)性對癌癥的發(fā)展和治療所產(chǎn)生的影響[9]，能夠讓我們對疾病有更加深入的了解，從而制定更為有效的治療對策。此外，法醫(yī)學(xué)通常只有少量的材料可供分析，而能從少量的材料中獲得結(jié)果則得益于先進(jìn)的單細(xì)胞技術(shù)[10]。基于PCR反應(yīng)的短串聯(lián)重復(fù)序列 (Short tandem repeat，STR) 分型是法醫(yī)鑒定的有力工具。而基于液滴微流體技術(shù)的單細(xì)胞STR分型技術(shù)，具有高靈敏度、高通量和高保真度，該技術(shù)在分析不同細(xì)胞材料時，對保持單一基因組的完整性十分有效[11]。在臨床生殖醫(yī)學(xué)方面，人卵母細(xì)胞的單細(xì)胞基因組分析對于減數(shù)分裂研究和植入前基因組篩查非常重要?；诙嘀赝嘶瓠h(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增 (Multiple annealing and looping based amplification cycles, MALBAC) 的體外受精植入前基因組篩查可以精確和經(jīng)濟(jì)地選擇出可用于胚胎移植的正常受精卵[12]。

隨著人們對單細(xì)胞研究的深入，單細(xì)胞基因組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)正經(jīng)歷著突飛猛進(jìn)的發(fā)展[13]。雖然單細(xì)胞研究與多細(xì)胞研究相比具有多種優(yōu)勢，但存在單細(xì)胞挑取和單細(xì)胞基因組擴(kuò)增等難題。文中將從單細(xì)胞挑取、單細(xì)胞DNA分析、單細(xì)胞RNA分析、單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析等方面介紹單細(xì)胞研究現(xiàn)狀。

1 單細(xì)胞分離技術(shù)

單細(xì)胞分離是單細(xì)胞分析的主要難點(diǎn)之一。文中將主要介紹以下3種單細(xì)胞分離技術(shù)。

1.1 顯微移液法

常見的顯微移液法可以在非常簡單的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，例如用胰酶將培養(yǎng)細(xì)胞或者組織中的細(xì)胞消化，形成分散的單細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至一定比例 (例如約500個單細(xì)胞均勻分布在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中)，在顯微鏡下尋找單細(xì)胞，并用移液器吸取單細(xì)胞。除了上述方法，還能借助克隆環(huán)[14]挑取單細(xì)胞。先制備一個含有單克隆的平板，在顯微鏡下找到滿意的單克隆并標(biāo)記，用鑷子將克隆環(huán)輕放至標(biāo)記處并滴加胰酶消化，待細(xì)胞變圓后，用移液器吸取單細(xì)胞[15]。手工挑取單細(xì)胞對操作者、操作環(huán)境都有較高的要求，并且在吸液時容易吸到多個細(xì)胞，可能因操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，但因其操作簡便、成本低廉，是實(shí)驗(yàn)室分離單細(xì)胞最常用的技術(shù)。

1.2 激光捕獲顯微切割 (Laser capture microdissection, LCM)

激光捕獲顯微切割 (LCM) 是一種通過顯微鏡尋找感興趣的細(xì)胞，利用激光從非均一組織切片或活細(xì)胞培養(yǎng)中分離高純度細(xì)胞群或單細(xì)胞的技術(shù)[16-18]。LCM一般分為兩類：紅外 (IR) 捕獲系統(tǒng)[16-17,19-20]和紫外 (UV) 切割系統(tǒng)[21-22]。目前，主要有4種類型的激光顯微切割儀，工作原理各異。

最早問世的激光顯微切割儀基于紅外 (IR)捕獲系統(tǒng)和紫外 (UV) 切割系統(tǒng)。紅外激光捕獲感興趣的細(xì)胞，紫外激光能顯微切割所捕獲的細(xì)胞。其工作原理為：首先，在倒置顯微鏡下找到感興趣的細(xì)胞，將熱塑性聚合物薄膜放在組織切片感興趣的細(xì)胞上；操作者使用激光脈沖激活熱塑性聚合物薄膜，使薄膜熔化并包圍感興趣的細(xì)胞；所形成的聚合物細(xì)胞復(fù)合物易從組織中轉(zhuǎn)移出來，并用提取緩沖液溶解聚合物膜釋放感興趣的細(xì)胞[16-18]。

其余3種激光顯微切割儀都是采用紫外激光系統(tǒng)，它們各有特色。其中一種依賴重力的激光顯微切割儀，其特點(diǎn)在于不移動樣品，而是移動激光。在正置顯微鏡下找到目標(biāo)細(xì)胞后，使用高精度光學(xué)部件將激光束沿著棱鏡上的期望切割線引導(dǎo)到組織上，切割目標(biāo)區(qū)域，目標(biāo)細(xì)胞將通過重力掉落到收集管中[23-24]。由于不接觸樣品，能使污染風(fēng)險降到最低。另一種激光顯微切割儀基于光壓反彈分離系統(tǒng)。在倒置顯微鏡下找到目標(biāo)細(xì)胞，利用高精度聚焦激光束切割樣品后，發(fā)射一個激光脈沖，利用激光將目標(biāo)細(xì)胞彈射至收集器中。該激光顯微切割儀也不接觸樣品，能夠快速、無污染地分離目的細(xì)胞。最后一種激光顯微切割儀的特點(diǎn)在于樣品的制備。樣品被放置在MembraneSlide上，MembraneSlide是覆蓋一層惰性薄膜的玻片，該薄膜有可以忽略不計的自體熒光；然后，將membraneslide倒置于載玻片上以防止污染。固態(tài)紫外激光器發(fā)射的紫外激光經(jīng)聚焦透鏡聚焦，在經(jīng)偏振光合束器合成一束后進(jìn)入相差顯微鏡，電腦控制玻片移動切割樣品，切割下來的目的細(xì)胞可附著在具有黏性的分離帽上[25]。加入溶解緩沖液，管子倒置約10 min。細(xì)胞將處于懸浮狀態(tài)，可以進(jìn)行下游處理。

激光捕獲顯微切割 (LCM) 能分離研究人員感興趣的特定細(xì)胞，而不污染周邊細(xì)胞[16-17,26]。LCM操作簡便，能精準(zhǔn)分離目的細(xì)胞，但顯微和激光設(shè)備成本較高，而且通過LCM獲得的單細(xì)胞基因組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量一直比較差[27]。LCM的另一個缺陷是，對于組織樣品，常常需要切片后才能在顯微鏡下觀察，但是切片過程常常會在縱向上把一個細(xì)胞切成好幾塊薄層，我們用LCM得到的單細(xì)胞，常常只是單細(xì)胞的一個薄層而已，會缺失很多亞細(xì)胞定位特異性的物質(zhì)；同時，染色體也有可能在切片時被切斷，導(dǎo)致DNA分析出現(xiàn)偏差。

1.3 微流體技術(shù)

微流體技術(shù)是指在微米級別下操縱流體的技術(shù)，常用于需要對流體進(jìn)行操作的生物實(shí)驗(yàn)。微流體輔助細(xì)胞篩選 (MACS) 通過向液流通道中注入細(xì)胞，并以逐漸壓縮通道高度的方式工作以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分離[13,28]。

基于微流體技術(shù)工作的單細(xì)胞自動制備系統(tǒng)能在微流體芯片 (Integrated fluidic circuit,IFC) 中將單細(xì)胞分離至個體反應(yīng)室中，并用于mRNA測序、DNA測序、表觀遺傳學(xué)或miRNA表達(dá)等下游分析。使用該系統(tǒng)制備單細(xì)胞的核心過程主要包括5個步驟：首先，對于固體組織或貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，需要適當(dāng)?shù)南?，而流體組織或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)需要亞群富集；進(jìn)一步富集細(xì)胞；之后，需要進(jìn)一步富集和染色細(xì)胞；然后在使用該系統(tǒng)之前進(jìn)行質(zhì)量控制；最后可以通過微流體分離單個細(xì)胞。與顯微移液法和激光捕獲顯微切割 (LCM) 分離單細(xì)胞相比，單細(xì)胞自動制備系統(tǒng)對操作者技術(shù)要求不高、耗時短，僅需1 h就能捕獲96個單細(xì)胞，并且能夠分辨所捕獲的單細(xì)胞是活細(xì)胞還是死細(xì)胞，同時能將單細(xì)胞捕獲及后期的基因組、mRNA、蛋白質(zhì)等分析完全自動化。

另一種單細(xì)胞分離儀基于數(shù)字液滴技術(shù)[29]。在一次性微流控芯片中，將單細(xì)胞和barcodes封裝到近乎納升的液滴中，細(xì)胞裂解及逆轉(zhuǎn)錄等后續(xù)一系列反應(yīng)將在液滴中進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物可用于后續(xù)單細(xì)胞RNA測序。該單細(xì)胞分離儀的優(yōu)勢在于每天能處理成千上萬個細(xì)胞，且可直接進(jìn)行下游分析。

2 單細(xì)胞分析

2.1 單細(xì)胞DNA分析

20世紀(jì)70年代DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)使得測定生命體的核酸組成成為現(xiàn)實(shí)[30-31]?；赑CR法的基因組測序已在20世紀(jì)90年代被用于人類單細(xì)胞分析[32]，約10年后出現(xiàn)了等溫擴(kuò)增法[33-34]。單細(xì)胞基因組測序技術(shù)已被用于分析人類單個生殖細(xì)胞的重組模式和非整倍體性[12,35]，以及腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞中基因組的異質(zhì)性[36]。

然而，要進(jìn)行單細(xì)胞基因組測序，就必須以單細(xì)胞微量的基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，這成為單細(xì)胞分析的另一難點(diǎn)。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增在過去10年中已有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[37]。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增主要有三大類方法。第一類方法完全基于PCR擴(kuò)增，采用隨機(jī)引物擴(kuò)增單細(xì)胞基因組，如DOP-PCR (Degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction)[38]、PEP-PCR (Primer extension preamplif ication PCR)[32]等。這種方法會優(yōu)先擴(kuò)增基因組中特定的位點(diǎn)，這將導(dǎo)致基因組覆蓋率低，但擴(kuò)增均勻性更好[27]。第二類方法基于等溫法，最常用的是多重置換擴(kuò)增 (Multiple displacement amplification, MDA)。采用等溫隨機(jī)引物與具有持續(xù)合成能力、高保真性和鏈置換活性的phi29聚合酶延伸基因組[39]，并通過鏈的置換而不斷進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。與PCR法相比，等溫法基因組覆蓋率更高，但指數(shù)擴(kuò)增將導(dǎo)致第一擴(kuò)增位點(diǎn)比例過高[40]。第三類方法將PCR法和等溫法相結(jié)合，克服了PCR法覆蓋率低以及等溫法不均勻的缺點(diǎn)。通過限制等溫擴(kuò)增反應(yīng)的時間，避免了指數(shù)擴(kuò)增的缺陷，以等溫擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得全基因組序列[41]。多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù) (Multiple annealing and looping based amplification cycles, MALBAC)[42]屬于第三類方法。MALBAC的關(guān)鍵在于只復(fù)制原始基因組DNA，而不復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物3′端和5′端通過互補(bǔ)形成環(huán)狀而被保護(hù)起來[43]。2017年4月，研究人員開發(fā)出一種新型單細(xì)胞基因組擴(kuò)增法——LIANTI (Linear amplification with transposon insertion)[44]。LIANTI通過插入含有T7啟動子的Tn5轉(zhuǎn)座子而對單細(xì)胞基因組進(jìn)行線性擴(kuò)增，能避免指數(shù)擴(kuò)增導(dǎo)致的偏倚和誤差[44]。

目前市場上主要有4款單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒：QIAGEN單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒 (REPLI-g Single Cell Kit)、億康基因MALBAC單細(xì)胞DNA快速擴(kuò)增試劑盒 (MALBAC Single Cell DNA Quick-Amp Kit)、SIGMA 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒(GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit) 和Rubicon單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒(PicoPLEX DNA-seq Kit)。這4種單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增比較結(jié)果如表1所示。

目前單細(xì)胞基因組測序技術(shù)發(fā)展迅猛，雖然市面上已有許多單細(xì)胞基因組擴(kuò)增試劑盒，但基于目前單細(xì)胞基因組擴(kuò)增的原理，這些試劑盒還存在許多缺陷，如基因組覆蓋率不能達(dá)到100%、擴(kuò)增過程會導(dǎo)致等位基因丟失、單細(xì)胞擴(kuò)增成本昂貴、無法同時對大量單細(xì)胞樣本進(jìn)行擴(kuò)增等[49]。隨著對單細(xì)胞的深入研究，研究者有望開發(fā)出新的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，研發(fā)出集單細(xì)胞分離、基因組擴(kuò)增和高通量測序?yàn)橐惑w的儀器設(shè)備，大大減少單細(xì)胞研究的成本和耗時。

表1 4種單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒比較Table 1 Comparison of 4 single cell whole genome amplification kits

2.2 單細(xì)胞RNA分析

單細(xì)胞RNA測序是研究細(xì)胞發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的一個有效方法[50]，某些新的細(xì)胞類型的發(fā)現(xiàn)就得益于單細(xì)胞RNA測序，單細(xì)胞RNA測序也為了解調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了深刻見解[51]。

2017年，10X Genomics公司開發(fā)出一個基于液滴技術(shù)的單細(xì)胞捕獲系統(tǒng)。該技術(shù)的核心是乳液中的凝膠珠 (Gel bead in emulsion，GEM)，凝膠珠由Illumina測序接頭、引物、10× barcodes、分子標(biāo)簽 (Unique molecular identifiers，UMI) 和oligo-dT組成。凝膠珠在微流體芯片的通道中與單細(xì)胞結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄發(fā)生在每一個凝膠珠，帶有條形碼的cDNA大量擴(kuò)增，構(gòu)成cDNA庫。其采用的微流控芯片有8個通道，一次可以同時處理8個樣品，每個通道每6 min可以產(chǎn)生約100 000個凝膠珠，加入芯片的細(xì)胞約50%能被捕獲[52]。目前，該技術(shù)已被用于免疫、腫瘤等方面的研究并取得相關(guān)進(jìn)展，如CD8+T細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)分析[53]、通過研究卡介苗對造血干細(xì)胞的作用為疫苗研發(fā)提供了新思路[54]、人腦膠質(zhì)瘤的單細(xì)胞分析為其治療提供了新策略[55]等。

除此之外，Shiroguchi等開發(fā)了一種數(shù)字RNA測序技術(shù)，通過加入過量的barcodes序列，使幾乎每個cDNA分子兩端都帶上不同的barcodes。PCR后，應(yīng)用雙末端深度測序可以讀取兩個barcodes和cDNA序列，大大降低了序列依賴性偏倚和擴(kuò)增噪音[56]。MALBAC除了能用于單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，還可用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，且擴(kuò)增產(chǎn)物檢測效率高、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性好[57]。

單細(xì)胞RNA測序非常適合解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的復(fù)雜性和動態(tài)性問題，目前已被應(yīng)用到大腦分子的分類研究，且有望應(yīng)用于開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病的新療法[58]?；诟咄繙y序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析已經(jīng)應(yīng)用于數(shù)百項(xiàng)研究中，并取得了豐碩的成果，使具有挑戰(zhàn)性的新生物發(fā)現(xiàn)成為可能[59]。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法的最新進(jìn)展，已經(jīng)使科學(xué)家認(rèn)識到許多表面上均質(zhì)的細(xì)胞具有令人驚訝的表達(dá)差異性。此外，非編碼RNA (Noncoding RNA，ncRNA) 被認(rèn)為是基因調(diào)控過程的關(guān)鍵元件，其在單細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式可能有助于剖析單細(xì)胞變異的生物學(xué)功能。測量單個細(xì)胞中的ncRNA對于研究細(xì)胞類型和單細(xì)胞功能具有重要意義[60]。

2.3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析

顯然，單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組只是它的一部分，單細(xì)胞的大多數(shù)功能是由其蛋白質(zhì)組決定的。目前蛋白質(zhì)組分析方法有蛋白質(zhì)芯片[61]、流式細(xì)胞儀分析[62]、免疫共沉淀[63]、質(zhì)譜分析[64]等，這些方法揭示了樣品中蛋白質(zhì)的性質(zhì)。自從單細(xì)胞研究興起后，研究人員對單細(xì)胞蛋白質(zhì)也進(jìn)行了不少研究。早在2009年，激光燒蝕電噴霧電離質(zhì)譜就被用于單細(xì)胞原位代謝組學(xué)分析[65]。曾有研究人員采用同位素標(biāo)記和質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法對造血系統(tǒng)的單細(xì)胞中34種物質(zhì)進(jìn)行分析，有助于盡早發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變，研發(fā)出針對性治療藥物[78]。基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的研究能為癌癥診斷和確定患者預(yù)后提供生物標(biāo)記物[66]。

雖然已有許多研究者對單細(xì)胞蛋白、代謝進(jìn)行了相關(guān)研究，但這些研究并不是真正意義上對單顆細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的研究。無論是質(zhì)譜、同位素標(biāo)記、還是流式細(xì)胞分析，都只是單細(xì)胞層面的蛋白質(zhì)分析，他們并沒有將單顆細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來，并進(jìn)行放大用于研究。這是由于單細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和代謝物含量極低、分離困難，目前還沒有與核酸類似的蛋白質(zhì)和代謝物的擴(kuò)增方法[67]，對單細(xì)胞蛋白質(zhì)的研究仍存在許多技術(shù)難點(diǎn)。測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞DNA和RNA分析，但基于測序的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法尚未見報道[68]。

2.4 單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)

表觀基因組學(xué)的研究對象，主要是基因組DNA序列的修飾構(gòu)象，并將其與表觀遺傳記憶、細(xì)胞識別和具有組織特異性的生物學(xué)功能聯(lián)系起來[85]。對于差異很小的細(xì)胞種群、罕見的細(xì)胞類型以及來源于組織的難以區(qū)分的不同細(xì)胞混合物，乃至于看似極具有同源性的細(xì)胞種群，都會在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平和表型上呈現(xiàn)出極大的差異。單細(xì)胞表觀基因組學(xué)的研究，有望解決傳統(tǒng)的對群體細(xì)胞進(jìn)行研究的技術(shù)缺陷，并為涉及發(fā)育、細(xì)胞異質(zhì)性等重要領(lǐng)域的表觀遺傳學(xué)研究開辟新的方向[69]。

單細(xì)胞表觀基因組學(xué)的研究方法有：單細(xì)胞DNA甲基化分析、單細(xì)胞染色質(zhì)映射、單細(xì)胞Hi-C、單細(xì)胞復(fù)制動力學(xué)等[69]。

單細(xì)胞表觀基因組學(xué)的研究方法可以識別染色質(zhì)的狀態(tài)是開放或是關(guān)閉，包括核小體定位，由此可以推斷某些轉(zhuǎn)錄因子是否結(jié)合在個別細(xì)胞內(nèi)特定的DNA序列[70]。隨著單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，如今，我們可以在單個細(xì)胞分辨率上來研究大多數(shù)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。單細(xì)胞表觀基因組學(xué)填補(bǔ)了表觀遺傳學(xué)發(fā)展過程中，傳統(tǒng)顯微鏡檢查與現(xiàn)代基因組學(xué)之間的歷史鴻溝，有望成為表觀遺傳學(xué)和基因組調(diào)控研究的重要工具[69]。

2.5 循環(huán)腫瘤單細(xì)胞分析

循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (Circulating tumor cell，CTC)源自原發(fā)性腫瘤或者轉(zhuǎn)移性病變，蘊(yùn)含有與腫瘤進(jìn)展和癌癥治療相關(guān)分子特征等重要信息[71]，因此對CTC的分析具有重大的臨床意義。

CTC的單細(xì)胞分子分析已經(jīng)產(chǎn)生了一系列意料之外的發(fā)現(xiàn)，例如癌細(xì)胞群體的異質(zhì)性，腫瘤對化學(xué)療法產(chǎn)生抗性的原因，以及腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制[72]。目前高通量測序技術(shù)、微流體技術(shù)等技術(shù)已被用于CTC單細(xì)胞研究。通過研究CTC所揭示的腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，對于理解和預(yù)測各種實(shí)體瘤治療過程中耐藥性的發(fā)展，以及為癌癥的有效治療制定適當(dāng)?shù)牟呗裕哂兄匾呐R床意義[73]。

2.6 單細(xì)胞分析研究成果

近年來，研究者對單細(xì)胞的不斷深入研究已取得累累碩果。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種致命的腦瘤，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，雖然靶向mTORC1/C2的CC214-2抑制劑抑制mTOR信號，但癌細(xì)胞迅速激活其他信號以促進(jìn)耐藥性[74]。單細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)繪制了單個腫瘤細(xì)胞中的信號網(wǎng)絡(luò)，使研究者發(fā)現(xiàn)了癌細(xì)胞生長的其他路徑，有助于開發(fā)更有效的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤聯(lián)合療法[74]；Navin利用單細(xì)胞全基因組測序分析了96例肝癌細(xì)胞和15例正常肝細(xì)胞，證實(shí)了拷貝數(shù)變異發(fā)生在肝癌早期，但在肝癌發(fā)展過程中保持相對穩(wěn)定，并發(fā)現(xiàn)znf717基因是肝細(xì)胞癌的一個潛在驅(qū)動基因，這些發(fā)現(xiàn)揭示了肝細(xì)胞癌中多個不同的腫瘤進(jìn)化機(jī)制，為腫瘤治療策略的制定提供了幫助[75-76]。單細(xì)胞RNA測序發(fā)現(xiàn)了新型免疫細(xì)胞，為研究免疫反應(yīng)提供了另一種途徑。根據(jù)RNA測序數(shù)據(jù)，科學(xué)家開發(fā)了一種新的算法來重建配對的T細(xì)胞受體 (TCR) 序列，并將T細(xì)胞特異性與功能性反應(yīng)相關(guān)聯(lián)[77]；通過對648個單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序的分析，應(yīng)用t-SNE細(xì)胞分型、SCDE基因差異表達(dá)分析，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了新的免疫細(xì)胞CD62L+ILC3[78]。最近的進(jìn)展，如大規(guī)模并行單細(xì)胞RNA-Seq和復(fù)雜的計算方法，正在催化我們對免疫學(xué)理解的一場革命。近年來大規(guī)模的單細(xì)胞RNA測序使研究者對免疫學(xué)有了更加深刻的理解，例如單細(xì)胞技術(shù)有望用于解讀免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性和固有成分[79]。單細(xì)胞RNA測序被用于分類成年小鼠視皮層的皮質(zhì)細(xì)胞，確定了49種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組類型，包括23種GABAergic、19種glutamatergic和7種非神經(jīng)型，揭示細(xì)胞類型的多樣性[80]?；贛ALBAC技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)前診斷新方法，以及在它的基礎(chǔ)上開發(fā)的胚胎植入前基因組篩查技術(shù)——MARSALA (Mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and linkage analyses)，可以同時檢測單基因疾病和非整倍體，并且能夠以經(jīng)濟(jì)有效的方式進(jìn)行連鎖分析，這可使父母免于將他們的遺傳病傳遞給后代[81-82]。

2.7 單細(xì)胞研究優(yōu)勢和局限

單細(xì)胞研究的主要優(yōu)勢體現(xiàn)在疾病分析方面，多細(xì)胞分析可能會掩蓋了群體中細(xì)胞特征的真實(shí)變異。以單細(xì)胞作為疾病分析的生物學(xué)單位，可以更準(zhǔn)確地記錄細(xì)胞反應(yīng)的個體和范圍，其價值逐漸得到認(rèn)可。單細(xì)胞研究可以鑒定腫瘤內(nèi)罕見的基因突變，更好地了解信號傳導(dǎo)和代謝途徑，制定最佳治療方案以防止腫瘤再生[83]。

單細(xì)胞科學(xué)試圖測量跨細(xì)胞群體的生物異質(zhì)性，以提供對整體生物學(xué)狀態(tài)或疾病狀態(tài)的定量描述。例如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以提供關(guān)于細(xì)胞之間的生物變異信息[83]。在單細(xì)胞研究的數(shù)據(jù)分析方面，雖然許多方法已成功用于分析大量樣本的基因組數(shù)據(jù)，但對于相對較短的測序讀長，數(shù)據(jù)的稀疏結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞群異質(zhì)性對有效的數(shù)據(jù)分析提出了重大的挑戰(zhàn)[84]。

3 本實(shí)驗(yàn)室工作內(nèi)容和經(jīng)驗(yàn)

在“國家自然科學(xué)基金”等項(xiàng)目的資助下，本團(tuán)隊對單細(xì)胞操作和分析已有一定研究基礎(chǔ)，并在實(shí)踐解決問題的過程中積累了一定經(jīng)驗(yàn)。

本團(tuán)隊近期的主要研究課題之一是CRISPR基因編輯技術(shù)。眾所周知，在CRISPR編輯基因組時有可能發(fā)生脫靶效應(yīng)，同時在編輯之后，靶細(xì)胞會啟動DNA的損傷修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)的過程中可能會導(dǎo)致一些意料之外的堿基的插入或缺失，這一現(xiàn)象具有潛在的副作用，比如可能會引發(fā)腫瘤相關(guān)基因的過表達(dá)或抑制，進(jìn)而限制了CRISPR技術(shù)的臨床應(yīng)用安全性。而此前在CRISPR基因編輯副作用方面的研究，主要以細(xì)胞群體 (多細(xì)胞) 為主[85-87]，本實(shí)驗(yàn)室嘗試將CRISPR基因編輯技術(shù)與單細(xì)胞研究相結(jié)合，在單細(xì)胞水平上檢驗(yàn)CRISPR基因編輯技術(shù)對細(xì)胞的影響，爭取打破多細(xì)胞研究的局限。

例如，在單細(xì)胞挑取方面，本課題組結(jié)合各種單細(xì)胞分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為了達(dá)到最好的精確度，采用的單細(xì)胞分離方法為人工顯微移液法。經(jīng)過不斷的實(shí)驗(yàn)以及條件優(yōu)化，我們總結(jié)出用1 mL培養(yǎng)基重懸約500個單細(xì)胞，并均勻鋪于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，此時的細(xì)胞密度在顯微鏡下挑取單細(xì)胞較為適合，容易在顯微鏡下找到單個細(xì)胞，并且不易吸到多個細(xì)胞。

本團(tuán)隊在單細(xì)胞基因組擴(kuò)增方面，曾嘗試使用基于phi29 DNA 聚合酶的多種單細(xì)胞DNA擴(kuò)增技術(shù)和基于PCR的單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)，使用phi29技術(shù)時，本團(tuán)隊已經(jīng)能夠從單個細(xì)胞中擴(kuò)增獲得長度大于21 kb的單細(xì)胞基因組，對擴(kuò)增所得基因組進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，基于phi29 DNA聚合酶的單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增單細(xì)胞基因組所產(chǎn)生的偏倚和誤差非常嚴(yán)重，基因組的部分區(qū)域大量擴(kuò)增，而某些區(qū)域則幾乎沒有擴(kuò)增，在SNP分析中，也許可以通過擴(kuò)大測序數(shù)據(jù)量來解決問題，而在CNVs等分析中就顯得無能為力，但是phi29方法的最大好處在于能夠得到大于21 kb的基因組序列，非常適于分析SV?；赑CR技術(shù)的單細(xì)胞擴(kuò)增，可以解決上述擴(kuò)增覆蓋率不均勻的問題，但是缺點(diǎn)在于擴(kuò)增片段長度很短。此外，本團(tuán)隊還將開展CRISPR編輯后的單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析。相關(guān)研究對于驗(yàn)證CRISPR基因編輯技術(shù)的副作用有重要意義。

4 展望

單細(xì)胞的分離技術(shù)，從最初的顯微移液法到激光捕獲顯微切割，一直到近年來最先進(jìn)的微流體技術(shù)，朝著自動化和高通量以及高精度的方向發(fā)展，這一切都離不開材料科學(xué)、納米科學(xué)、自動化技術(shù)的進(jìn)步。但是，現(xiàn)有的單細(xì)胞分離技術(shù)，基本上都局限在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系，隨著科學(xué)研究的深入，能否開發(fā)出直接從活體組織，尤其是實(shí)體組織里分離單細(xì)胞的技術(shù)？畢竟，體內(nèi)狀態(tài)下的細(xì)胞和體外的細(xì)胞有著非常大的區(qū)別，只有對體內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行研究，才是反映最真實(shí)的自然狀態(tài)，才能幫助我們理解最真實(shí)的生命過程。另外，體內(nèi)條件下獲得的單細(xì)胞，常常在生物醫(yī)學(xué)上有重要用途，比如用于腫瘤標(biāo)記物的研究、腫瘤干細(xì)胞研究、免疫治療研究、再生醫(yī)學(xué)研究等等。但是，這就有很多工程技術(shù)上的問題需要克服，首先是活體、尤其是實(shí)體組織如何取材？如何把組織分散為單個的細(xì)胞？當(dāng)然，血液等流體會相對容易。其次，活體的細(xì)胞，無論在細(xì)胞形狀、大小、細(xì)胞活性、狀態(tài)，都與體外的細(xì)胞系有很大的區(qū)別，活體細(xì)胞常常是高度分化的，一塊組織中可能有多種不同類型的細(xì)胞，把細(xì)胞分類就是一個很大的難題，此外不同細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)的含量常常具有重大差異，即便分離出活體單細(xì)胞，后續(xù)分析能否勝任極度微量的物質(zhì)的分析？另外，有些細(xì)胞種群是非常稀有罕見的，如何在活體里提取、分揀和富集這些稀有的細(xì)胞，難度也非常大。此外，活體的某些類型單細(xì)胞，在組織解離分散、流體分揀挑選等過程，在各種不同的物理和化學(xué)環(huán)境中能否保持存活狀態(tài)？隨著高精度手術(shù)機(jī)器人、納米機(jī)器、磁珠分離、人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)等技術(shù)的興起，也許單細(xì)胞的分離技術(shù)能夠更加先進(jìn)、更加智能，例如可以根據(jù)研究目的和需求，可以更加有選擇性、目的性和高精度，比如優(yōu)選地挑取有特殊形狀、特殊狀態(tài)、特殊顏色的細(xì)胞，或者根據(jù)所檢測到的細(xì)胞狀態(tài)和類型，將細(xì)胞分配到不同的物理和化學(xué)條件下進(jìn)行分揀，比如自動選擇不同的pH和不同滲透壓的緩沖液，以及選擇不同流體剪切力和不同孔徑大小的流體腔室，以保證單細(xì)胞分離的成功，減少人工的干預(yù)和誤判，這應(yīng)是將來的發(fā)展方向之一。

在單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分析層面，本文從DNA、RNA、蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行了介紹。隨著新一代測序技術(shù)的崛起，目前對于單細(xì)胞DNA和RNA的分析已經(jīng)趨于成熟。但是仍有可以發(fā)展的空間。例如，現(xiàn)有的單細(xì)胞DNA分析，所涉及到的單細(xì)胞DNA擴(kuò)增技術(shù)，難免會造成擴(kuò)增后的產(chǎn)物和原始的DNA存在偏倚，因此，目前也有很多科學(xué)家在開發(fā)具有高保真、能忠實(shí)還原原始DNA信息的單細(xì)胞DNA擴(kuò)增技術(shù)，目前最先進(jìn)的高通量單細(xì)胞分離 (微流體技術(shù))，還只能用于RNA分析，而對單細(xì)胞DNA分析不兼容。這就限制了單細(xì)胞DNA分析的通量和成本。在單細(xì)胞RNA分析領(lǐng)域，缺少能對單細(xì)胞總RNA直接進(jìn)行大量擴(kuò)增的技術(shù)，因此，對于一些微量或半衰期極短的RNA分子，現(xiàn)有的分析技術(shù)的靈敏度可能無法企及，而且RNA的種類眾多，例如長的非編碼RNA、mRNA、環(huán)狀RNA、miRNA、piRNA、rRNA、tRNA等等，現(xiàn)有的單細(xì)胞RNA分析技術(shù)，絕無能力把不同類型的RNA進(jìn)行純化和分類，而不同類型的RNA，其分析和測序方法也不同，因此，在單細(xì)胞RNA分析層面，還有很多技術(shù)需要深入發(fā)展，事實(shí)上，現(xiàn)有的單細(xì)胞RNA測序，也僅僅只能分析mRNA等少數(shù)幾種類型的RNA。另外，現(xiàn)有的單細(xì)胞DNA和RNA分析技術(shù)，很大程度上依賴于Illumina的測序技術(shù)，但是它的讀長一般都只有幾百個bp，比較短。在DNA層面，若要發(fā)現(xiàn)SV和CNV和融合基因；在RNA層面，若要發(fā)現(xiàn)可變剪接，較長讀長的測序技術(shù)顯然更有優(yōu)勢，但是，目前尚未見成熟的、能和較長讀長測序技術(shù)兼容的單細(xì)胞DNA和RNA分析技術(shù)。在蛋白質(zhì)分析方面，現(xiàn)有的研究報道少之又少，單細(xì)胞層面的蛋白質(zhì)質(zhì)譜、蛋白質(zhì)測序，甚至蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對工程技術(shù)的要求比其他任何生物分析都高，蛋白是生命的基礎(chǔ)，其種類和數(shù)量眾多，但在目前的技術(shù)背景下，對單細(xì)胞蛋白進(jìn)行定性和定量分析，仍是無法逾越的。

此外，在單細(xì)胞內(nèi)還存在各種糖類、脂類物質(zhì)，它們對細(xì)胞的各種生物學(xué)行為也有重大調(diào)控作用，另外，不同的單細(xì)胞相互之間存在通訊交流的現(xiàn)象，這也是單細(xì)胞研究需要關(guān)注的內(nèi)容。另外，近年來單分子的研究發(fā)展也非常迅速，比如單分子熒光[88]、單分子成像[89]等，將單分子技術(shù)結(jié)合單細(xì)胞研究技術(shù)也是未來的發(fā)展方向之一。實(shí)時成像可以對動態(tài)的細(xì)胞生命過程進(jìn)行可視化和分析，例如單細(xì)胞成像有助于研究胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)和形態(tài)發(fā)生的過程，神經(jīng)元回路和非神經(jīng)元細(xì)胞類型對神經(jīng)功能的貢獻(xiàn)，基于成像的新方法還能以高時空分辨率解析神經(jīng)疾病和癌癥[90]。除此之外，單細(xì)胞研究在原位轉(zhuǎn)錄組分析、實(shí)時成像轉(zhuǎn)錄組分析、譜系示蹤技術(shù)、單細(xì)胞多組學(xué)、細(xì)胞狀態(tài)分布建模與預(yù)測、細(xì)胞功能驗(yàn)證、疾病研究、跨學(xué)科研究等方面[73]，具有較好的發(fā)展前景和空間。

5 結(jié)語

DNA、RNA、蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞的基礎(chǔ)物質(zhì)，細(xì)胞又是構(gòu)成生命的基本單元。細(xì)胞存在分化和異質(zhì)性，細(xì)胞和細(xì)胞之間的差異造成了不同的生命功能和生物學(xué)現(xiàn)象。只有深入研究單細(xì)胞，把傳統(tǒng)的在組織學(xué)、多細(xì)胞層面的研究深入到單細(xì)胞層面，才能更好地了解生命，揭示分子機(jī)制。無論在生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究，還是在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究，或是生物工程學(xué)研究，單細(xì)胞研究必定是未來的重點(diǎn)研究方向之一。

隨著單細(xì)胞分析技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，單細(xì)胞分析也將在各種疾病中得到廣泛應(yīng)用。在腫瘤治療方面，單細(xì)胞全基因組測序?qū)ふ彝蛔兾稽c(diǎn)、研究腫瘤的進(jìn)化機(jī)制意義重大。而對單細(xì)胞蛋白質(zhì)的分析，能夠研究正常和病變細(xì)胞的信號通路，揭示癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為腫瘤的治療提供全新的思路。在免疫系統(tǒng)研究方面，單細(xì)胞研究有助于發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞，通過對免疫細(xì)胞信號通路的研究，能為疫苗的研制與開發(fā)提供深刻見解。在生殖健康方面，單細(xì)胞全基因組測序能夠檢測出堿基片段缺失或增添，有助于避免遺傳疾病。雖然，單細(xì)胞分析技術(shù)有著眾多優(yōu)勢，但其發(fā)展和成熟之路卻將漫長而艱難。