頭孢妥侖匹酯有關(guān)物質(zhì)的合成及其結(jié)構(gòu)確證

朱希 高浩凌 范鋼 盛力 沈大冬,*

(1 浙江省紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，紹興 312071；2 浙江醫(yī)藥股份有限公司研究院，紹興 312500)

頭孢妥侖匹酯(cefditoren pivoxil)是日本明治制果株式會(huì)社研制的第四代頭孢菌素類抗生素，具有廣泛的抗菌作用，尤其對(duì)葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌、大腸埃希菌、卡他布蘭漢球菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、流感嗜血菌等革蘭陰性菌以及消化鏈球菌屬、痤瘡丙酸桿菌、擬桿菌屬等厭氧菌有很強(qiáng)的抗菌力，其作用機(jī)制為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成與各種細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的親和性高，發(fā)揮殺菌作用[1-2]。藥品中有關(guān)物質(zhì)的種類和含量直接決定藥品的安全性，為確保安全性，就要求對(duì)藥品有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析[3]。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道頭孢妥侖匹雜質(zhì)的合成及其結(jié)構(gòu)確證，僅有文獻(xiàn)[4-5]通過LC-MS對(duì)其雜質(zhì)的分析，本研究在課題研究的基礎(chǔ)上[6-7]，根據(jù)美國藥典公布的頭孢妥侖匹酯的雜質(zhì)譜[8]，通過化學(xué)法合成3個(gè)雜質(zhì)(圖1)，并運(yùn)用HMR、HRMS等分析方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳解，為質(zhì)量研究和控制提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent1260高效液相色譜(美國Agilent公司)、AgilentTechnologies 6520液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)、Bruker AvanceDMX400超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司)、熔點(diǎn)儀(YRT-3，天大天發(fā)科技有限公司)。

圖1 雜質(zhì)A、B、C的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of the impurities A, B and C

試劑：7-氨基-3-(4-甲基噻唑基)-3-頭孢環(huán)-4-羧酸(自制)、頭孢妥侖匹酯(自制)、AE活性酯(百靈威科技有限公司)，其他試劑均為AR。

1.2 HPLC方法

色譜柱：YMC-Pack ODS-AM(150mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相為23mmol/L磷酸二氫鈉水溶液(磷酸調(diào)pH至3.0):甲醇:乙腈=2:1:1(V/V/V)；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫為30℃。

1.3 合成方法與結(jié)果

1.3.1 雜質(zhì)A(頭孢妥侖酸鈉)的合成

反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入THF(80mL)、7-氨基-3-(4-甲基噻唑基)-3-頭孢環(huán)-4-羧酸(5.00g, 14.5mmol)，室溫滴加5%NaHCO3(50mL)溶液，攪拌至溶解澄清，加入AE活性酯(5.58g, 15.9mmol)，室溫反應(yīng)5h，滴加丙酮(110mL)，析出固體，過濾，用丙酮(50mL)洗濾餅，干燥得淺黃色固體A(6.40g，83.6%)，mp. 197～200℃(文獻(xiàn)[9]鈉鹽：195～200℃)，純度93.87%，HRMS，m/z：507.0578[M+H]+。

1.3.2 雜質(zhì)B(Δ-3異構(gòu)體)的合成

反應(yīng)瓶中加入THF(50mL)、頭孢妥侖匹酯(5.00g, 8.1mmol)，攪拌溶解澄清后，加入濃氨水(2.0mL)，45℃油浴反應(yīng)12h，硅膠柱層析純化(VDCM:VMeOH=20:1)得到2.4g粗品。粗品再由制備色譜柱分離提純，得到白色固體B(2.12g, 42.4%)，純度90.63%，HRMS，m/z：621.1254[M+H]+。

1.3.3 雜質(zhì)C(特戊酰胺取代物)的合成

反應(yīng)瓶中加入THF(50mL)、頭孢妥侖匹酯(5.00g, 8.1mmol)，室溫?cái)嚢柚寥芙獬吻?，加入NaHCO3(2.30g)，N2置換保護(hù)，轉(zhuǎn)移至-10℃下，緩慢滴加特戊酰氯(2mL)，攪拌30min，室溫反應(yīng)24h。加入純化水(200mL)，用乙酸乙酯(40mL×4)萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水(20mL×2)洗滌，無水Na2SO4干燥，硅膠柱層析純化(VDCM:VMeOH=1:0～70:1)得到C(4.84g，84.7%)，純度95.38%，HRMS，m/z：705.1827[M+H]+。

2 結(jié)構(gòu)確證

2.1 雜質(zhì)A

外觀為淺黃色固體，HRMS顯示[M+H]+離子峰為507.0578，其熔點(diǎn)為197～200℃(文獻(xiàn)[9]鈉鹽：195～200℃)，推測(cè)分子式為C19H17N6O5S3Na。樣品的1H NMR顯示有17個(gè)氫[δ3.071(2H, dd)、δ1.193(2H, t)為雜質(zhì)峰]，其中有3個(gè)氫[δ9.670(1H, d,J=8.0Hz)、δ7.242(2H, s)]經(jīng)D2O交換消失，為活潑氫。13C NMR和DEPT135°顯示有19個(gè)碳[δ45.91、δ8.94為雜質(zhì)峰]，其中9個(gè)伯碳或叔碳、1個(gè)仲碳、9個(gè)季碳(表1～2)。

COSY譜中，仲氨質(zhì)子氫δ9.670(1H, d,J=8.0Hz)與δ5.844(1H, dd,J=3.6, 4.8Hz)相關(guān)，δ5.844(1H, dd,J=3.6, 4.8Hz)與δ5.247(1H, d,J=5.2Hz)相關(guān)，結(jié)合HSQC譜，因此可將δ5.844(1H, dd,J=3.6, 4.8Hz)、δ5.247(1H, d,J=5.2Hz)分別歸屬為H-6、H-7，δ59.24、δ58.06分別歸屬為C-6、C-7；HMBC譜中，仲氨質(zhì)子氫與δ163.27相關(guān)，H-6和H-7與δ164.05相關(guān)，可將δ163.27、δ164.05分別歸屬為C-5、C-8。

表1 雜質(zhì)A、B、C氫譜數(shù)據(jù)Tab. 1 1H NMR data of the impurities A, B and C

HMBC譜中，甲基氫δ2.371(3H, s)、δ8.940(1H,s)分別與δ126.54、δ152.55都相關(guān)，另一甲基氫δ3.840(3H, s)沒有相關(guān)的碳信號(hào)，可將δ2.371(3H,s)、δ8.940(1H, s)、δ3.840(3H, s)分別歸屬為H-17、H-16、H-19，結(jié)合HSQC譜可將δ15.74、δ153.49、δ62.38、δ126.54、δ152.55分別歸屬為C-17、C-16、C-19、C-14、C-15。

結(jié)合HSQC譜和COSY譜，仲碳(δ27.48)上的氫分裂為δ3.488(1H, d,J=10.4Hz)、δ3.338(1H, d,J=10.0Hz)，可歸屬為H-11，δ27.48歸屬為C-11。COSY譜中，δ6.349(1H, d,J=11.6Hz)和δ6.703(1H, d,J=12.0Hz)相關(guān)，HMBC譜中，δ6.703(1H, d,J=12.0Hz)與C-14、C-15，可將δ6.349(1H, d,J=11.6Hz)、δ6.703(1H, d,J=12.0Hz)分別歸屬為H-12、H-13，結(jié)合HSQC譜，δ128.17、δ121.54分別歸屬為C-12、C-13；H-11、H-12、H-13與δ126.28、δ126.67都相關(guān)，可將δ126.28、δ126.67分別歸屬為C-9、C-10。

剩余氫δ6.740(1H, s)可歸屬為H-2，結(jié)合HSQC譜，δ109.40歸屬為C-2；HMBC譜中，H-2與δ168.87、δ149.44、δ143.00相關(guān)，由于H-2與δ149.44相關(guān)信號(hào)較弱，C-1位連接氨基，可將δ168.87、δ149.44、δ143.00分別歸屬為C-1、C-4、C-3。

表2 雜質(zhì)A、B、C碳譜數(shù)據(jù)Tab. 2 13C NMR data of the impurities A, B and C

2.2 雜質(zhì)B

外觀為白色固體，HRMS顯示[M+H]+離子峰為621.1254，推測(cè)分子式為C25H28N6O7S3。樣品的1H NMR顯示有28個(gè)氫，其中有3個(gè)氫[δ8.016(1H, d,J=8.4Hz)、δ5.673(2H, s)]經(jīng)D2O交換消失，為活潑氫。13C NMR和DEPT135°顯示有23個(gè)碳，其中11個(gè)伯碳或叔碳、1個(gè)仲碳、11個(gè)季碳，HSQC譜顯示δ1.172(9H, s)為單峰與δ26.78相關(guān)，可判斷叔丁基碳信號(hào)疊加，因此該分子共有25個(gè)碳(表1～2)。

由HSQC譜可將δ1.172(9H, s)歸屬為H-23、H-24、H-25，δ26.78歸屬為C-23、C-24、C-25；HMBC譜圖中，δ1.172(9H, s)與δ38.76、δ176.82相關(guān)，因羰基碳位于低場(chǎng)，可將δ38.76歸屬為C-22，δ176.82歸屬為C-21。仲碳δ80.34歸屬為C-20，δ5.757(2H, s)歸屬為C-20，再結(jié)合HSQC譜，δ5.757(2H, s)歸屬為H-20。

COSY譜中，仲氨質(zhì)子氫δ8.016(1H, d,J=8.4Hz)與δ5.920(1H, t,J=4.4Hz)相關(guān)，δ5.920(1H, t,J=4.4Hz)與δ5.456(1H, s)相關(guān)，結(jié)合HSQC譜，因此可將δ5.920(1H, t,J=4.4Hz)、δ5.456(1H, s)分別歸屬為H-6、H-7，δ60.06、δ53.23分別歸屬為C-6、C-7；HMBC譜中，仲氨質(zhì)子氫與δ162.54相關(guān)，H-6 和H-7與δ164.56相關(guān)，可將δ162.54、δ164.56分別歸屬為C-5、C-8。

HMBC譜中，δ2.442(3H, s)、δ8.423(1H, s)分別與δ126.12、δ153.86都相關(guān)，可將δ2.442(3H, s)、δ8.423(1H, s)分別歸屬為H-17、H-16，δ126.12、δ153.86分別歸屬為C-14、C-15；結(jié)合HSQC譜，可將δ15.65、δ151.43分別歸屬為C-17、C-16。

COSY譜中，δ5.955(1H, d,J=11.6Hz)與δ6.574(1H, d,J=11.2Hz)相關(guān)，結(jié)合HMBC譜，δ6.574(1H, d,J=11.2Hz)與C-14、C-15相關(guān)，可將δ5.955(1H, d,J=11.6Hz)、δ6.574(1H, d,J=11.2Hz)分別歸屬為H-12、H-13，結(jié)合HSQC譜，δ126.149、δ122.18分別歸屬為C-12、C-13。

HMBC譜中，C-12與δ4.962(1H, s)、δ6.415(1H,s)相關(guān)，δ4.962(1H, s)與低場(chǎng)碳δ165.84相關(guān)，可將δ4.962(1H, s)、δ6.415(1H, s)分別歸屬為H-9、H-11，δ165.84歸屬為C-18，結(jié)合HSQC譜，可將δ51.48、δ122.54分別歸屬為C-9、C-11。結(jié)合H-9和HMBC譜，可將δ118.98歸屬為C-10。

剩余的甲基氫δ4.016(3H, s)和δ6.802(1H, s)可分別歸屬為H-19、H-2，結(jié)合HSQC譜，可將δ63.12、δ111.77分別歸屬為C-19、C-2。HMBC譜中，C-2與δ168.25、δ142.34、δ147.29相關(guān)，C-1上連接氨基，可將低場(chǎng)碳δ168.25歸屬為C-1，由于C-2與δ142.34相關(guān)信號(hào)較強(qiáng)，因此可將δ142.34、δ147.29分別歸屬為C-3、C-4。

2.3 雜質(zhì)C

外觀為白色固體，HRMS顯示[M+H]+離子峰為705.1827，推測(cè)分子式為C30H36N6O8S3。樣品的1H NMR顯示有36個(gè)氫，其中有2個(gè)氫[δ7.537(1H, d,J=8.4Hz)、δ9.514(1H, s)]經(jīng)D2O交換消失，為活潑氫。13C NMR和DEPT135°顯示有26個(gè)碳，其中12個(gè)伯碳或叔碳、2個(gè)仲碳、12個(gè)季碳，HSQC譜顯示δ1.318(9H, s)、δ1.147(9H, s)為單峰分別與δ27.07、δ26.75相關(guān)，可判斷叔丁基碳信號(hào)疊加，因此該分子共有30個(gè)碳(表1～2)。

HMBC譜中，δ1.318(9H, s)與δ176.69、δ39.21相關(guān)，δ1.147(9H, s)與δ176.82、δ39.21相關(guān)，仲碳δ5.829(2H, dd,J=5.2, 5.6Hz)與δ176.82、δ159.99相關(guān)，可將δ1.318(9H, s)歸屬為H-28、H-29、H-30，δ1.147(9H, s)歸屬為H-23、H-24、 H-25，δ176.82、δ176.69、δ159.99、δ39.21、δ39.21分別歸屬為C-21、C-26、C-18、C-27、C-21；結(jié)合HSQC譜，δ26.75歸屬為C-23、C-24、 C-25，δ27.07歸屬為C-28、C-29、 C-30。

COSY譜中，仲氨質(zhì)子氫δ7.573(1H, d,J=8.4Hz)與δ6.078(1H, dd,J=4.0, 4.8Hz)相關(guān)，δ6.078(1H, dd,J=4.0, 4.8Hz)與δ5.221(1H, d,J=5.2Hz)相關(guān)，結(jié)合HSQC譜，因此可將δ6.078(1H, dd,J=4.0, 4.8Hz)、δ5.221(1H, d,J=5.2Hz)分別歸屬為H-6、H-7，δ59.21、δ57.58分別歸屬為C-6、C-7；HMBC譜中，仲氨質(zhì)子氫δ7.573(1H, d,J=8.4Hz)與δ162.32相關(guān)，H-6 和H-7與δ164.15相關(guān)，可將δ162.32、δ164.15分別歸屬為C-5、C-8。

HMBC譜中，甲基氫δ2.442(3H, s)、δ6.665(1H, d,J=11.6Hz)、δ8.615(1H, s)分別與δ125.86、δ153.14都相關(guān)，COSY譜中，δ6.363(1H, d,J=11.6Hz)與δ6.665(1H,d,J=11.6Hz)相關(guān)，因此可將δ2.442(3H, s)、δ6.363(1H,d,J=11.6Hz)、δ6.665(1H, d,J=11.6Hz)、δ8.615(1H,s)分別歸屬為H-17、H-12、H-13、H-16，δ125.86、δ153.14分別歸屬為C-14、C-15；結(jié)合HSQC譜，可將δ15.54、δ126.44、δ122.24、δ152.17分別歸屬為C-17、C-12、C-13、C-16。

結(jié)合HSQC譜和COSY譜，仲碳(δ28.20)上的氫分裂為δ3.295(1H, d,J=18.8Hz)、δ3.518(1H, d,J=19.2Hz)，可歸屬為H-11，δ27.48歸屬為C-11。HMBC譜中，H-11與δ124.88、δ130.30相關(guān)，H-12與δ124.88相關(guān)，H-13與δ130.30相關(guān)，可將δ124.88、δ130.30分別歸屬為C-9、C-10。

剩余氫δ7.258(1H, s)可歸屬為H-2，結(jié)合HSQC譜，δ116.63歸屬為C-2；HMBC譜中，H-2與δ158.97、δ147.19、δ140.81相關(guān)，由于H-2與δ147.19相關(guān)信號(hào)較弱，C-1位連接酰胺基，可將δ158.97、δ147.19、δ140.81分別歸屬為C-1、C-4、C-3。

3 討論

頭孢妥侖匹酯是臨床上應(yīng)用較廣的抗生素，其有關(guān)物質(zhì)非常復(fù)雜，僅美國藥典公布的雜質(zhì)譜就超過10個(gè)，目前除少數(shù)幾種工藝雜質(zhì)外，大多數(shù)雜質(zhì)尚未對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，因此制備各種有關(guān)物質(zhì)并進(jìn)行確證對(duì)提高頭孢妥侖匹酯的質(zhì)量及其控制至關(guān)重要。本研究利用化學(xué)法合成得到3個(gè)雜質(zhì)：頭孢妥侖酸鈉、Δ-3異構(gòu)體、特戊酰胺取代物，并運(yùn)用一維和二維核磁共振、質(zhì)譜等檢測(cè)方法對(duì)其碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了詳細(xì)的解析和歸屬，為頭孢妥侖匹酯的雜質(zhì)研究和質(zhì)量控制提供了參考。