甲狀旁腺素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞對骨質(zhì)疏松大鼠股骨頸骨密度相關(guān)指標的影響

張澤華，霍建忠，郭耀，季興華

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院骨科，太原 030001)

骨質(zhì)疏松癥是因骨量丟失、骨強度降低及骨微觀結(jié)構(gòu)改變從而增加了脆性骨折風(fēng)險的一種疾病，它給醫(yī)學(xué)帶來了挑戰(zhàn)并對社會經(jīng)濟造成了威脅。骨質(zhì)疏松患者的終生骨折風(fēng)險高達40%，而發(fā)生骨折最常見的部位為脊柱、髖部及手腕，其他部位也可發(fā)生，如肱骨、肋骨等[1]。骨質(zhì)疏松癥的藥物治療主要分為兩類，一類為促骨形成類藥物，如甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)，代表藥物特立帕肽；另一類為抗骨吸收藥物，如雙磷酸鹽類[2]。從細胞水平、動物實驗及患者臨床的應(yīng)用方面，單純應(yīng)用PTH治療骨質(zhì)疏松的有效性已被證實[3-5]，但PTH聯(lián)合用藥存在局限性，如不推薦與抗骨吸收類藥物聯(lián)用[6]，是否能尋找另一種非藥物途徑來聯(lián)合PTH進行骨質(zhì)疏松治療是一個亟待解決的臨床問題。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)廣泛存在于人體骨髓及松質(zhì)骨中，可在體內(nèi)進行自我復(fù)制,并成為骨組織修復(fù)以及相關(guān)疾病的治療選擇[7]。BMSCs具有多向分化能力，目前在體外的提純與擴增技術(shù)已成熟?；谏鲜霰尘埃狙芯吭隗w外構(gòu)建組織工程擴增BMSCs，再將其注入骨質(zhì)疏松大鼠模型的股骨頸內(nèi)，隨后單獨或聯(lián)合使用PTH，通過Micro-CT測量反映骨密度的相關(guān)指標變化，初步研究BMSCs聯(lián)合PTH對骨質(zhì)疏松性大鼠的局部成骨效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

大鼠雌激素ELISA試劑盒(美旋生物科研試劑上海有限公司)；水合氯醛(天津盛鑫源化學(xué)試劑有限公司)；胎牛血清(ScienCell生命科技有限公司)；DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基、無菌PBS溶液、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、含EDTA的0.25%胰蛋白酶(武漢博士德生物工程有限公司)；成骨細胞誘導(dǎo)液 (Cyagen Biosciences，美國)；Rat PTH 1-34(默克生命科學(xué)上海有限公司)；全波長酶標儀Eppendorf(中國生命科技有限公司)；Micro-CT(SCANCO Medical AG Inc，瑞士)。

1.2 實驗動物及骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建

SD IGS雌性大鼠50只，2月齡，SPF級，體質(zhì)量(210±20)g，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實驗中心動物房，正常攝食、進水。將50只雌性大鼠按隨機數(shù)字表法分為A、B、C、D、E 5組，每組10只。濃度8%水合氯醛腹腔麻醉，B、C、D、E組經(jīng)大鼠腰背部切口進入腹腔切除雙側(cè)卵巢， A組僅切除卵巢周圍同等大小的脂肪組織。手術(shù)后12周，分別在每組按抽樣檢驗法抽取3只大鼠，心臟穿刺取血液2 ml，1000轉(zhuǎn)/min離心10 min，收集血清加入大鼠雌激素試劑盒，450 nm酶標儀測定各孔吸光度值，分別計算各組大鼠雌激素平均濃度。隨后將每組抽取的3只大鼠處死，采用Micro-CT檢測股骨頸的骨密度相關(guān)指標，即骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)和骨體積分數(shù)(bone volume to tissue volume,BV/TV)。

1.3 BMSCs培養(yǎng)與鑒定

健康SD IGS雄性大鼠5只，4周齡，SPF級，平均體質(zhì)量80 g，相關(guān)指標符合實驗動物標準。脫頸法處死，碘伏全身浸泡消毒5 min，超凈工作臺上分離雙側(cè)股骨，剪掉兩端骨骺，用含10%FBS的DMEM/F12 1∶1完全培養(yǎng)基沖出骨髓至15 ml離心管中，反復(fù)吹打，1000轉(zhuǎn)/min離心3 min，棄上清，加入8 ml完全培養(yǎng)基吹打混勻后接種在4個25 cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中， 4 ml/瓶，置37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后半量更換培養(yǎng)基，以后每3 d全量更換新鮮培養(yǎng)基。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底至細胞融合成單層、密度為80%～90%時，用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。待傳至P3代時，選擇生長狀態(tài)良好的細胞至離心管，0.25%胰酶消化，4℃離心，1000轉(zhuǎn)/min，離心3 min，用PBS(含1%胎牛血清)充分洗滌細胞3次，重懸細胞，各管依次加入單克隆抗體CD34、CD45、CD29、CD90，流式細胞儀進行檢測分析。

1.4 術(shù)后干預(yù)

術(shù)后12周，每組剩余7只大鼠。A、B組不做干預(yù)處理，其中B組為骨質(zhì)疏松空白對照組；C組按60 μg/kg劑量背部皮下注射Rat PTH 1-34，隔日1次[8]，連續(xù)注射12周(PTH干預(yù)組)；D組顯露雙側(cè)股骨頸，采用旋轉(zhuǎn)進針法注入0.5 ml濃度為5×108/ml的BMSCs(BMSCs干預(yù)組)；E組在D組基礎(chǔ)上背部皮下注射Rat PTH 1-34，注射濃度、頻率與C組一致(PTH聯(lián)合BMSCs干預(yù)組)。

1.5 干預(yù)后大鼠股骨頸骨密度相關(guān)指標變化

各組剩余大鼠均在干預(yù)12周后處死。大鼠經(jīng)解剖、分離雙側(cè)股骨，小心剔除周圍肌肉后經(jīng)Micro-CT檢測Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp及BV/TV，并行三維圖像重建。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型鑒定

術(shù)后12周，A組大鼠雌激素濃度為(496.2±14.7)ng/L，B、C、D及E組大鼠雌激素濃度分別為(361.7±17.3)、(359.3±15.3)、(362.8±13.9)和(360.9±16.5)ng/L，與A組比較，B、C、D及E組雌激素水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但B、C、D及E組間差異不明顯(P>0.05)。Micro-CT檢測5組股骨頸骨密度相關(guān)性指標發(fā)現(xiàn)，A組Tb.N、Tb.Th、BV/TV均明顯高于其余4組，Tb.Sp明顯低于其余4組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但B、C、D、E組各組間骨密度相關(guān)性指標結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表1)。由此可以證明B、C、D、E組骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功[9]。

2.2 BMSCs形態(tài)與鑒定

BMSCs接種24 h后觀察可見部分細胞貼壁，48 h后光鏡下可見培養(yǎng)瓶底部有少量梭形細胞，高倍鏡下核仁清晰可見。3 d后再次換液可見密集的細胞團，呈漩渦狀(圖1)。傳代后細胞貼壁較原代快，形態(tài)均勻，生長迅速。流式細胞技術(shù)單標法顯示，P3代細胞表達CD29(99.86%)、CD90(99.73%)，幾乎不表達CD34(6.48%)、CD45(0.94%)(圖2)，表明本研究成功獲取并培養(yǎng)了BMSCs。

2.3 干預(yù)12周后骨密度相關(guān)指標變化

Micro-CT數(shù)據(jù)顯示，單獨使用PTH、注入BMSCs及聯(lián)合使用二者均可改善骨微觀結(jié)構(gòu)，但均未達到與A組相似的正常水平。與B組比較，C、D、E組的Tb.N、Tb.Th及BV/TV顯著增加，Tb.Sp顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與C或D組比較，E組Tb.N、Tb.Th及BV/TV亦顯著增加，Tb.Sp顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表2)。各組Micro-CT骨形態(tài)學(xué)三維重建見圖3。

3 討 論

隨著“老年世紀”的到來，如何有效治療骨質(zhì)疏松癥已成為當前臨床的熱點問題，而成功構(gòu)建骨質(zhì)疏松的動物模型是實驗進行的關(guān)鍵一步。切除卵巢后的大鼠模型與絕經(jīng)后女性在骨質(zhì)疏松生理變化過程上相似，已成為建立骨質(zhì)疏松的經(jīng)典模型之一[10]。

表1 術(shù)后12周各組大鼠股骨頸Micro-CT檢測數(shù)據(jù)

A: sham operation group; B: osteoporosis group; C: PTH intervention group; D: BMSCs intervention group: E: PTH-BMSCs intervention group. Tb.N: trabecular number; Tb.Th: trabecular thickness; Tb.Sp: trabecular separation; BV/TV: bone volume to tissue volume. Compared with group A,*P<0.05.

圖1 原代培養(yǎng)BMSCs的光學(xué)顯微鏡觀察

圖2 大鼠BMSCs流式細胞技術(shù)鑒定

A: sham operation group; B: osteoporosis group; C: PTH intervention group; D: BMSCs intervention group: E: PTH-BMSCs intervention group. Compared with group A,*P<0.05; compared with group B,#P<0.05; compared with group C,△P<0.05; compared with group D,▲P<0.05.

圖3 各組大鼠股骨頸三維重建圖像

在正常的人體骨髓中，主要有兩類細胞，即起源于造血干細胞的造血細胞和起源于BMSCs的間充質(zhì)細胞[11]。BMSCs具有自我更新的多向分化潛能，在實驗室中不同的誘導(dǎo)條件下，BMSCs可分化為成骨細胞、成脂細胞、成軟骨細胞等，其數(shù)量與活性在骨組織重建及維持骨量、增強骨密度等方面起著至關(guān)重要的作用[12]。有研究表明[13]，老年人群中BMSCs的增殖與分化能力均有不同程度下降，導(dǎo)致骨形成速度減慢，其直接后果是骨量的丟失和骨微結(jié)構(gòu)的破壞，這與骨質(zhì)疏松的病理觀察相符。經(jīng)典胚胎學(xué)研究和體外成體器官研究表明，微環(huán)境在干細胞的自我更新和分化中起著決定性作用[14]。本實驗結(jié)果也表明，與骨質(zhì)疏松空白對照組比較，BMSCs干預(yù)組及BMSCs聯(lián)合PTH干預(yù)組中Tb.N、Tb.Th及BV/TV顯著增加，Tb.Sp顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與文獻報道一致[15]。但如何使注入的BMSCs更多地向成骨方面增殖、分化將是今后在研究詳細機制方面的熱點與難點。

目前，一種人工合成的PTH已被美國食品藥品管理局批準，其促骨形成藥物已在臨床上使用多年。PTH對骨代謝有雙重調(diào)節(jié)效應(yīng)，即小劑量間斷性應(yīng)用PTH能促進骨髓干細胞向成骨細胞的增殖、分化[16]，而大劑量連續(xù)使用則會上調(diào)核子-κB 受體活化因子配體的表達，降低骨保護素的表達，促進破骨細胞的生成并增強其活性，導(dǎo)致骨吸收。本研究選擇去勢大鼠來模擬臨床上的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女，隨后施加小劑量間斷性PTH(藥物治療)與局部注射BMSCs(細胞治療)干預(yù)，通過Micro-CT骨形態(tài)參數(shù)對比PTH與BMSCs單獨或聯(lián)合使用對骨質(zhì)疏松的改善作用。實驗結(jié)果顯示，單獨使用PTH或BMSCs均可以提高Tb.N、Tb.Th及BV/TV，降低Tb.Sp等相關(guān)骨性指標，且二者聯(lián)合使用在抑制骨質(zhì)疏松大鼠骨量丟失、改善骨微觀結(jié)構(gòu)等方面總體效果更好，但其具體機制目前尚不清楚。查閱文獻[17,18]，我們推測大體機制如下。體外培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)局部注射后，在骨髓微環(huán)境及基質(zhì)中各種因子的作用下進行自我擴增并向成骨方向分化，這一過程使得注射部位骨量及骨骼強度增加。而PTH則是一種能促進BMSCs向成骨方向分化的重要激素，可通過與成骨細胞表面受體結(jié)合，激活cAMP/Ca2+/蛋白激酶C/磷酯酶C等信號通路，增強Ⅰ型膠原等成骨相關(guān)基因的表達，刺激成骨細胞的活性，從而促進骨再生，提高骨轉(zhuǎn)換指標，增加新骨的形成，迅速增加骨量，進而提高骨密度，降低發(fā)生骨折的風(fēng)險。

綜上，PTH聯(lián)合BMSCs對骨質(zhì)疏松大鼠模型的干預(yù)效果比單獨使用二者效果顯著。本研究創(chuàng)新點在于這種聯(lián)合治療的方法彌補了臨床上對骨質(zhì)疏松患者無合適聯(lián)合藥物治療的局限，并已顯示出傳統(tǒng)治療方法不可比擬的優(yōu)勢，隨著研究的不斷深入，相信該聯(lián)合治療方法將會為臨床上越來越多的骨質(zhì)疏松患者提供治療選擇。但也存在不足之處，如股骨頸注入BMSCs時無特定專用器械致細胞損失，缺乏相應(yīng)的植入細胞標記及細胞植入后的活體示蹤等，需在今后的研究中繼續(xù)探討改進，并嘗試在椎體、脛骨等多部位注射進行驗證。