基于代謝組學(xué)的中藥質(zhì)量及機(jī)制研究＊

賈志鑫，徐文娟，馬愷悅，肖紅斌

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029）

中藥是中醫(yī)臨床應(yīng)用的重要形式，是辨證論治的集中體現(xiàn)，其多藥物、多成分的組方原則決定了其藥理作用機(jī)制的多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)。中藥的活性并不是簡(jiǎn)單多成分藥理指標(biāo)的疊加，而是不同活性成分相互作用（藥效上的協(xié)同或拮抗、毒性上的降低或增強(qiáng)），最終以網(wǎng)絡(luò)形式表達(dá)的整體藥效作用。中藥的多組分特征增加了研究的復(fù)雜性，使其質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究緩慢，成為制約中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化發(fā)展的瓶頸。建立符合中藥特征的研究模式，有效控制中藥質(zhì)量，系統(tǒng)闡釋中藥的科學(xué)內(nèi)涵，是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一。

系統(tǒng)生物學(xué)于1998年由美國(guó)的Leory Hood教授系統(tǒng)提出[1]，它是研究生物系統(tǒng)組成成分的構(gòu)成與相互關(guān)系的結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)與發(fā)生，以系統(tǒng)論和實(shí)驗(yàn)、計(jì)算方法整合研究為特征的生物學(xué)。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它興起于上世紀(jì)90年代中期且發(fā)展極為迅速。代謝組學(xué)把機(jī)體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來(lái)研究，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，其研究思路與中醫(yī)藥的整體觀和辨證論治特點(diǎn)吻合，在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制、藥效作用機(jī)制、毒性機(jī)制、安全性評(píng)價(jià)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊前景，為中藥復(fù)雜系統(tǒng)研究和新藥研發(fā)提供了有力手段。

傳統(tǒng)中藥研究多基于“還原論”進(jìn)行。這種方法雖然能研究的較為全面，但耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)、成本較高，且針對(duì)中藥的研究最后往往都變成了中藥零部件研究或單體成分藥研究，不符合中藥“系統(tǒng)性、整體性”的特點(diǎn)。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)中藥系統(tǒng)性認(rèn)識(shí)的不斷加深，研究思路正從還原性研究轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)性研究，實(shí)現(xiàn)從描述到預(yù)測(cè)的飛躍?；凇跋到y(tǒng)論”的中藥研究可借助代謝組學(xué)方法重點(diǎn)從藥物作用的通路、網(wǎng)絡(luò)入手進(jìn)行整合研究，以闡明中藥作用機(jī)制，把控中藥質(zhì)量，推動(dòng)中藥組合藥等新藥研發(fā)。

1 代謝組研究進(jìn)展

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）于1999年由Nicholson[2]首次提出，是研究生物體系受刺激或擾動(dòng)后（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后）其內(nèi)源代謝物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要組成部分。系統(tǒng)生物學(xué)主要由基因組學(xué)（genomics）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）、蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）和代謝組學(xué)等構(gòu)成。雖然基因組和蛋白質(zhì)組體現(xiàn)了生物功能代謝的上游信息，但二者的功能缺失可由其它基因或蛋白質(zhì)的存在而得到補(bǔ)償，其結(jié)果不一定會(huì)反映在生物體表型上。而小分子物質(zhì)的產(chǎn)生和代謝才是機(jī)體復(fù)雜代謝反應(yīng)的最終結(jié)果，它們能更直接、更準(zhǔn)確、無(wú)歧視的反映生物體的生理病理狀態(tài)。代謝組學(xué)在多種領(lǐng)域都有較好的應(yīng)用，其中以生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最為廣泛，常被用于發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物、研究發(fā)病機(jī)理、及評(píng)價(jià)藥物療效等。

國(guó)外有學(xué)者把代謝組學(xué)分為4個(gè)層次，即代謝靶標(biāo)分析（Target Analysis）、代謝輪廓分析（Metabolic Profiling）、代謝指紋分析（Metabolic Fingerprint-ing）和代謝組學(xué)[3,4]。這4個(gè)層次由單一靶目標(biāo)定量到多目標(biāo)定量，由結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相關(guān)的一類化合物的輪廓分析到全局化合物的輪廓分析，體現(xiàn)了代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展及研究理念的提升。代謝組學(xué)的研究策略主要包括代謝指紋譜分析和代謝靶標(biāo)分析。其中代謝指紋分析旨在對(duì)生物樣本中所有代謝物進(jìn)行分析，從整體的角度觀測(cè)生物體系對(duì)外界刺激的代謝變化響應(yīng)，進(jìn)而溯源上游的蛋白質(zhì)組乃至轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控機(jī)制。而代謝靶標(biāo)分析則聚焦特定的代謝通路，一次完成多種化合物定量分析。早期代謝組學(xué)研究以疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)為主要應(yīng)用方向，而代謝指紋譜分析“俯瞰”生物體系代謝物整體變化，是早期最主要的研究方式。隨著對(duì)復(fù)雜機(jī)體逐步深入的認(rèn)識(shí)，代謝組學(xué)研究從疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到代謝機(jī)制研究，代謝靶標(biāo)分析以其在定量方面的優(yōu)勢(shì)，成為目前代謝組學(xué)研究的主流方式。

1.1 代謝組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化研究

完整的代謝組學(xué)包括樣本準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)獲取、標(biāo)志物分析和網(wǎng)絡(luò)分析這幾個(gè)步驟。代謝組學(xué)技術(shù)和操作條件多種多樣，而大量樣本經(jīng)過(guò)前處理等環(huán)節(jié)所產(chǎn)生的誤差以及在數(shù)據(jù)獲取和分析中所引入的不確定性使研究者越來(lái)越意識(shí)到分析流程標(biāo)準(zhǔn)化的重要性。Zeper A等[5]進(jìn)行了代謝組學(xué)樣品穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)不同儲(chǔ)存條件下有36個(gè)代謝物差異顯著（P＜0.05），甚至有代謝物在-80℃保存5年后變化超過(guò)100倍，證明代謝組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化勢(shì)在必行。Lindon JC等[6,7]對(duì)代謝組學(xué)規(guī)范化研究進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)，并制訂和發(fā)布了有關(guān)代謝組分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告的詳細(xì)草案。Bino RJ等[8]提出了MIAMET的代謝物組學(xué)數(shù)據(jù)模式，除樣品收集、處理外，還涉及數(shù)據(jù)分析等各環(huán)節(jié)。Xu GW等長(zhǎng)期致力于樣品標(biāo)準(zhǔn)化獲取及處理的研究，考察了不同采血管、凍融次數(shù)、放置時(shí)間等因素對(duì)結(jié)果的影響[9]，比較了血漿、血清所獲得結(jié)果的區(qū)別[10]，為樣本標(biāo)準(zhǔn)化采集提供了參考方案。隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物具有難以重現(xiàn)甚至趨勢(shì)相反等現(xiàn)象。Xu GF和Zhang ZJ等[11]對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究，系統(tǒng)比較了歸一化數(shù)據(jù)預(yù)處理方法對(duì)生物標(biāo)志物篩選的影響，初步揭示了“代謝組學(xué)標(biāo)志物篩不對(duì)”、“實(shí)驗(yàn)室間可比性差”的原因，對(duì)于組學(xué)數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)化具有積極貢獻(xiàn)。

1.2 高覆蓋度的數(shù)據(jù)獲取

樣品數(shù)據(jù)獲取是代謝組學(xué)的核心關(guān)鍵技術(shù)，現(xiàn)階段技術(shù)手段以LC/MS、GC/MS以及NMR應(yīng)用最為廣泛。因各種技術(shù)均有相應(yīng)的適用范圍，且內(nèi)源性化合物種類繁多特點(diǎn)各異，并不能真正完全的表征全部?jī)?nèi)源性代謝物。如何開(kāi)發(fā)高覆蓋度的數(shù)據(jù)獲取策略成為研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。整合多種技術(shù)的代謝組學(xué)分析平臺(tái)（如靶向與非靶向技術(shù)結(jié)合），多種分析方法整合應(yīng)用以及計(jì)算機(jī)輔助文獻(xiàn)挖掘等方法成為新的發(fā)展趨勢(shì)。Xu GW等[12]結(jié)合UHPLC-HRMS和UHPLC-MS/MS的優(yōu)勢(shì)開(kāi)發(fā)了一種高覆蓋度的偽靶向脂質(zhì)組學(xué)分析方法，通過(guò)3377個(gè)靶向脂質(zhì)離子對(duì)測(cè)定了超過(guò)7000種脂質(zhì)化合物，為代謝組學(xué)高覆蓋度數(shù)據(jù)獲取提供了有力借鑒。如何囊括低豐度、高活性的代謝物信息也是代謝組學(xué)高覆蓋度數(shù)據(jù)獲取的發(fā)展方向。Zhang JL等[13]針對(duì)脂肪酸類化合物建立了衍生化方法，使該類化合物的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度提升了2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。Li L等[14]建立了化學(xué)同位素標(biāo)記液質(zhì)聯(lián)用方法用于人尿液中羥基化代謝物的高通量表征，可初步鑒定3093個(gè)峰中的2304個(gè)代謝物。以上方法提高了檢測(cè)靈敏度，擴(kuò)充了代謝組學(xué)所覆蓋化合物的廣度，以期盡可能更多、更完整的表征生物樣品中的內(nèi)源性代謝物信息。

1.3 標(biāo)志物識(shí)別及網(wǎng)絡(luò)分析

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)與多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法相結(jié)合，對(duì)機(jī)體內(nèi)代謝物進(jìn)行全面分析，表征差異性生物標(biāo)志物，探索其與生物體產(chǎn)生的生理、病理變化或藥物治療下生物體整體狀態(tài)改變的相關(guān)性[15]。

標(biāo)志物判別常采用主成分分析（PCA）、層次聚類分析（HCA）、非線性影射（NLM）等非監(jiān)督分類方法，以及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（NN）等監(jiān)督分類方法，其中PCA和PLS-DA應(yīng)用較為廣泛。劉昌孝等[16]對(duì)化學(xué)計(jì)量學(xué)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。標(biāo)志物的鑒定仍是目前的最具有挑戰(zhàn)的工作之一，研究者為此開(kāi)展了多方面研究，建立起系列數(shù)據(jù)庫(kù)用于精確分子量比對(duì)鑒定，如METLIN（www.metlin.scripps.edu）、MassBank（www.massbank.eu/MassBank/）、HMDB（www.hmdb.ca）等。Brüschweile R等[17]建立了MS/NMR聯(lián)用的代謝產(chǎn)物快速鑒定策略，鑒定了大腸桿菌提取物中氨基酸、核酸、核苷酸等化合物。Xu GW等[18]成功的將高分辨質(zhì)譜、微分離制備和色譜技術(shù)相結(jié)合，解析了能夠表征糖尿病的代謝產(chǎn)物的同分異構(gòu)體。后續(xù)在此基礎(chǔ)上不斷完善，形成標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并建立起約2000個(gè)化合物的實(shí)驗(yàn)室代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，成功應(yīng)用于血漿中202個(gè)代謝產(chǎn)物的鑒定[19]。

經(jīng)過(guò)近二十年的發(fā)展，代謝組學(xué)已由最初的差異代謝物發(fā)現(xiàn)、潛在標(biāo)志物篩選進(jìn)入到更深層次的相關(guān)代謝通路分析，且隨著生物大數(shù)據(jù)時(shí)代的來(lái)臨，代謝組學(xué)后期數(shù)據(jù)處理正逐步深入，嘗試與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，探討生物病理、藥物治療的機(jī)制研究，構(gòu)建標(biāo)志物與標(biāo)志物、標(biāo)志物與靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，觸及探究生命的本質(zhì)?；谝陨侠砟?，本課題組[20]探索性的通過(guò)代謝組學(xué)獲得丹紅注射液針對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化模型差異代謝物，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“活性單體藥效靶點(diǎn)－疾病通路蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究丹紅注射液的藥效傳遞特征途徑。Zhang ZJ等[21]利用代謝組學(xué)進(jìn)行雄黃毒性標(biāo)志物研究，在整合LC-MS、GCMS、NMR技術(shù)后得到50個(gè)生物標(biāo)志物，并構(gòu)建了受其影響的代謝網(wǎng)絡(luò)，指征到三羧酸循環(huán)、色氨酸代謝、能量代謝三個(gè)通路。Yao L、Wang XJ和Lu HT等[22]定義了精準(zhǔn)修飾代謝組學(xué)這一策略，靶向關(guān)注目標(biāo)代謝通路化合物，同時(shí)利用質(zhì)譜進(jìn)行同位素示蹤，然后分析關(guān)鍵調(diào)控基因和相關(guān)酶，深入研究致病性大腸桿菌引起尿路感染的診斷、病源機(jī)理，并助力創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)。

隨著儀器靈敏度的不斷提升、高通量組學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步、計(jì)算方法與能力的迅速發(fā)展、開(kāi)源數(shù)據(jù)的不斷積累，代謝組學(xué)進(jìn)入了全新的生物信息時(shí)代，其在中藥相關(guān)領(lǐng)域的研究也迎來(lái)了更好的發(fā)展契機(jī)。而如何實(shí)現(xiàn)代謝組學(xué)在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及機(jī)制研究中的應(yīng)用是所面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。本課題組為解決上述關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行了一系列的研究和探索，以期推動(dòng)代謝組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用，助力中藥新藥研發(fā)，推動(dòng)中藥國(guó)際化現(xiàn)代化進(jìn)程。

2 代謝組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用

2.1 中醫(yī)藥整體評(píng)價(jià)

中醫(yī)證候研究是指將中醫(yī)整體觀和中醫(yī)辨證施治觀相結(jié)合，綜合性的評(píng)價(jià)中醫(yī)診治疾病的本質(zhì)與作用規(guī)律，是中醫(yī)基礎(chǔ)研究中的核心研究?jī)?nèi)容，也是中醫(yī)學(xué)對(duì)疾病的一種特殊的研究和處理方法[23]。代謝組學(xué)反映的是人體整體代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)所有擾動(dòng)因素進(jìn)行整體回應(yīng)的結(jié)果，可能更接近于中醫(yī)“證”的內(nèi)涵[24]。Wang GJ等[25]開(kāi)展了臨床高血壓病人中醫(yī)辯證分型（包括肝火亢盛、痰濕雍盛及陰虛陽(yáng)亢三型）的血清代謝組學(xué)研究，利用PCA和馬氏距離法可明顯區(qū)分3種不同證型的高血壓病人，且后者可在一定程度上顯示3種證型的發(fā)展關(guān)系，符合中醫(yī)辨證分型的理論。此項(xiàng)研究證明了利用代謝組學(xué)研究技術(shù)揭示中醫(yī)“證”本質(zhì)的可能性。本課題組[26-28]基于代謝組學(xué)進(jìn)行糖尿病中醫(yī)證候研究。將氨基酸代謝輪廓譜與脂肪酸代謝輪廓譜作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)這兩類代謝成分的定量及關(guān)聯(lián)研究，尋找糖尿病及其中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期促進(jìn)糖尿病中醫(yī)診斷科學(xué)化、規(guī)范化。

中藥則是在中醫(yī)辨證施治、辨病理論基礎(chǔ)上，施以根據(jù)一定組方原則組成的多味中藥方劑或單味藥，是中醫(yī)臨床治療疾病的主要形式?；诖x組學(xué)對(duì)中藥進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)，既符合中藥多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜作用特點(diǎn)，又契合中醫(yī)證候整體觀、辨證治療的理論。Wang XJ等[29]運(yùn)用UPLC-MS技術(shù)研究溫心方治療心氣虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法表征了17個(gè)特異性生物標(biāo)志物及其代謝網(wǎng)絡(luò)，包括硬脂酸、尿酸、左旋肉堿、3-羥基犬尿氨酸等。結(jié)果顯示溫心方治療心氣虛證的作用途徑主要與生物體內(nèi)糖酵解、不飽和脂肪酸的合成代謝、糖異生代謝和嘌呤代謝密切相關(guān)，科學(xué)闡釋了中藥辨證施治的作用機(jī)理。本課題組[30]進(jìn)行了基于代謝組學(xué)的擇時(shí)合用中藥抗腎虛衰老研究。設(shè)立正常組、腎衰老模型對(duì)照組、腎衰老模型給藥組（不同時(shí)間給予不同中藥組合，共4組），創(chuàng)新性的結(jié)合GIOS變量篩選并進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)可顯著區(qū)分對(duì)照、模型及給藥組，且不同藥物干預(yù)組變化趨勢(shì)不同，體現(xiàn)了代謝組學(xué)對(duì)中藥的整體性評(píng)價(jià)。

2.2 中藥質(zhì)量標(biāo)志物篩選

圖1 基于代謝組學(xué)的中藥質(zhì)量標(biāo)志物篩選策略

傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究手段通常選擇含量高、有一定特征性的成分作為質(zhì)控指標(biāo)，但缺乏專屬性、溯源性和功能屬性相關(guān)性。代謝組學(xué)反映有機(jī)體整體代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)所有擾動(dòng)因素的完整、無(wú)歧視回應(yīng)的結(jié)果，全面考慮影響中藥材質(zhì)量的主要因素諸如品種、氣候、產(chǎn)地、采集季節(jié)以及炮制方法等。應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行專屬性質(zhì)量標(biāo)志物的篩選，可得到更加專屬穩(wěn)定、功能屬性相關(guān)、遵循組方配伍理論的指標(biāo)成分。中藥質(zhì)量標(biāo)志物這一概念由劉昌孝院士[31]提出并獲得國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者認(rèn)可，意在針對(duì)目前中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在的不足，形成針對(duì)反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制的重要新手段。

本課題組在前期研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析特點(diǎn)以及質(zhì)量標(biāo)志物的內(nèi)在屬性，提出了基于代謝組學(xué)的質(zhì)量標(biāo)志物篩選策略（圖1）。首先，借助本課題組前期建立的高靈敏的檢測(cè)分析技術(shù)，對(duì)樣品進(jìn)行全成分分析，隨后進(jìn)行標(biāo)志物的篩選，該部分作為本策略的核心板塊，分別從穩(wěn)定性、專屬性、功效相關(guān)性和代表性四部分對(duì)質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行篩選研究，最后通過(guò)定量分析、聚類及主成分分析等驗(yàn)證所篩選的質(zhì)量標(biāo)志物。

基于以上研究策略本課題組開(kāi)展了人參的質(zhì)量標(biāo)志物篩選研究[32]。目前藥典中規(guī)定的人參的質(zhì)控指標(biāo)為人參皂苷Rg和Re，而與人參相同種屬的三七、西洋參和珠子參藥材所含化學(xué)成分相近，在藥典質(zhì)控指標(biāo)近似的情況下無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分。因此以人參為例借助代謝組學(xué)篩選其特征質(zhì)量標(biāo)志物。首先，采用高靈敏采集方法對(duì)42個(gè)樣品進(jìn)行全成分分析，共解析出1634個(gè)成分。然后，借助代謝組學(xué)處理技術(shù)排除冗余成分，并通過(guò)分子離子排重、成分等操作，保留并確定人參分別區(qū)別于三七、西洋參、珠子參的關(guān)鍵專屬性成分。進(jìn)而，分別對(duì)保留的關(guān)鍵化合物進(jìn)行相關(guān)性分析，重點(diǎn)關(guān)注豐度較高并且與其它大部分專屬性成分含量呈正相關(guān)的成分作為人參的候選指標(biāo)成分。綜合考慮指標(biāo)成分穩(wěn)定性、含量等問(wèn)題，分別選擇竹節(jié)參皂苷Iva、人參皂苷Rf和人參皂苷Rc作為人參區(qū)別三七、西洋參和珠子參的指標(biāo)性成分。為了驗(yàn)證所選擇指標(biāo)成分的合理性，用人參的上述3個(gè)指標(biāo)成分對(duì)人參和西洋參、珠子參、三七這四種相似藥材進(jìn)行PCA分析和聚類分析，結(jié)果顯示四種藥材各自劃為一類，驗(yàn)證了借助代謝組學(xué)技術(shù)所選擇指標(biāo)成分具有合理性。

中醫(yī)臨床常以中藥材炮制品入藥，但炮制前后化學(xué)成分往往會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致藥性藥效的變化。因此，炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的確定對(duì)于臨床用藥療效和安全至關(guān)重要。本課題組以生、熟大黃為例，運(yùn)用代謝組學(xué)方法尋找炮制前后的質(zhì)量標(biāo)志物[33]。一方面通過(guò)靶向代謝組學(xué)，測(cè)定大黃炮制前后藥典指標(biāo)含量的變化情況；另一方面基于非靶向代謝組學(xué)，進(jìn)行全譜數(shù)據(jù)差異性分析，從大黃化學(xué)成分中找尋受炮制影響顯著的化學(xué)成分。靶向數(shù)據(jù)表明藥典中4個(gè)指標(biāo)性成分在炮制后含量下降幅度微小；非靶向數(shù)據(jù)表明模式識(shí)別可發(fā)現(xiàn)大黃炮制后有126個(gè)特征峰顯著變化，其中124個(gè)峰顯著下降，2個(gè)峰顯著升高。大黃炮制前后變化最顯著的化合物為原矢車菊素B5（或?yàn)槠洚悩?gòu)體），炮制前后含量下降顯著的蒽醌類化合物為大黃素-8-O-（6'-O-丙二?；┢咸烟擒眨ɑ?yàn)槠洚悩?gòu)體）。該結(jié)果提示，代謝組學(xué)可助力于藥材炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的篩選，為炮制藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

圖2 基于細(xì)胞代謝組學(xué)的中藥活性成分肝毒性機(jī)制探討

2.3 中藥作用機(jī)制研究

2.3.1 藥效作用機(jī)制研究

中藥作用機(jī)制的研究是闡明中醫(yī)辨證論治原理和推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要部分，不僅為中醫(yī)臨床合理使用方藥提供理論支撐，而且為新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)[34]。劉昌孝等[35]從代謝物組成分和量的經(jīng)時(shí)變化發(fā)現(xiàn)鉤藤等多味中藥的療效生物標(biāo)記物，認(rèn)為藥物的整體作用所產(chǎn)生的生物化學(xué)物質(zhì)（神經(jīng)遞質(zhì)）是其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，證明多動(dòng)合劑的作用機(jī)制可能與DA受體變化有關(guān)，開(kāi)創(chuàng)性的探索了中藥方劑作用機(jī)制的研究。

動(dòng)脈粥樣硬化是眾多缺血性心腦血管疾病的重要生理病理基礎(chǔ)。近年來(lái)本課題組基于代謝組學(xué)系統(tǒng)揭示動(dòng)脈粥樣硬化及腦中風(fēng)的代謝異常情況，并以此為基礎(chǔ)開(kāi)展丹紅藥效靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及量效調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)于指導(dǎo)臨床診斷以及新藥研發(fā)都具有重要意義。以巨噬細(xì)胞泡沫化作為動(dòng)脈粥樣硬化早期病理模型開(kāi)展代謝組學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)163個(gè)代謝物的分析，最終篩選出9個(gè)重要的生物標(biāo)志物及6條代謝通路。其中花生四烯酸代謝的貢獻(xiàn)最大，其關(guān)鍵代謝物AEA的含量上調(diào)，它的代謝產(chǎn)物均呈現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢(shì)，結(jié)合Western blot結(jié)果證明AEA代謝受阻是巨噬細(xì)胞泡沫化的主要特征[36]。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證PTGS2（前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物酶2）為疾病關(guān)鍵通路蛋白，Tan IIA-EDN1-PTGS2-AEA為T(mén)an IIA藥效傳遞特征途徑。此外課題組采用MCAO大鼠模型，基于代謝組學(xué)系統(tǒng)闡釋腦缺血代謝異常狀況[37]以及丹紅注射液（DHI）治療腦缺血的量效調(diào)控機(jī)制。選擇腦缺血特征網(wǎng)絡(luò)中41個(gè)關(guān)鍵代謝物開(kāi)展靶向代謝組學(xué)研究，篩選出DHI不同劑量的特征代謝標(biāo)志物。評(píng)估劑量相關(guān)藥理模塊中節(jié)點(diǎn)重要性明確Gly和Glu是劑量相關(guān)模塊網(wǎng)絡(luò)中最重要的節(jié)點(diǎn)。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證Glu-GLT-1/Gly-GlyRα是DHI調(diào)控的核心模塊單元[20]。

2.3.2 毒性作用機(jī)制研究

隨著中藥研發(fā)的現(xiàn)代化和國(guó)際化，其安全性倍受關(guān)注。與中藥藥效具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)相類似，中藥毒性作用也具有該特點(diǎn)，應(yīng)用反映整體思想的代謝組學(xué)評(píng)價(jià)中藥的毒性，對(duì)中藥毒性進(jìn)行系統(tǒng)、全面、整體的評(píng)價(jià)研究，對(duì)于建立現(xiàn)代中藥毒理評(píng)價(jià)體系，確保中藥的合理、安全、有效用藥，指導(dǎo)臨床用藥劑量和時(shí)間具有積極的意義。如針對(duì)傳統(tǒng)有毒中藥雷公藤，Su MX等[38]通過(guò)NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性代謝物檸檬酸、α-酮戊二酸、牛磺酸、氮氧、三甲胺(TMAO)和葡萄糖等發(fā)生了明顯變化。推測(cè)其毒性機(jī)制可能是其損傷了肝線粒體功能及干擾了能量代謝中的三羧酸循環(huán)，并導(dǎo)致葡萄糖代謝的紊亂。

本課題組[39]用大黃蒽醌單體干預(yù)制備肝損傷細(xì)胞模型，進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，對(duì)顯著變化的潛在生物標(biāo)志物及其代謝通路進(jìn)行研究，探討可能的肝損傷機(jī)制。對(duì)正常組細(xì)胞和大黃素干預(yù)組細(xì)胞模型進(jìn)行代謝物模式識(shí)別，鑒定得到26個(gè)與大黃素潛在肝損傷密切相關(guān)的代謝物，可明顯分為2類：以谷胱甘肽（GSH）為代表的氧化還原相關(guān)代謝物和與十八碳脂肪酸代謝相關(guān)的脂質(zhì)及長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化產(chǎn)物。在此研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)了大黃素與半胱氨酸形成的加和物，該加合物具有時(shí)間依賴、劑量依賴性。半胱氨酸與肽GSH代謝密切相關(guān)，數(shù)據(jù)表明，谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS在低濃度大黃素干擾時(shí)活升高，而中、高濃度時(shí)活性顯著下降。同時(shí)，半胱氨酸的代謝物是?；撬?，而?；撬崾呛铣赡懼岬闹饕煞?，其含量隨著大黃素濃度的增加呈現(xiàn)顯著性下降。因此我們推測(cè)，大黃素-半胱氨酸加和物的生成是肝毒性發(fā)生的重要觸發(fā)點(diǎn)。

3 討論及展望

代謝組學(xué)技術(shù)正處于蓬勃發(fā)展的時(shí)期，但仍面臨著諸多不足，如不能完全鑒定生物有機(jī)體的全部小分子化合物、無(wú)法完成所有目標(biāo)化合物的定量測(cè)定工作、不同實(shí)驗(yàn)室之間仍然存在測(cè)定結(jié)果和分析結(jié)果偏差等?？蒲泄ぷ髡咭呀?jīng)意識(shí)到相關(guān)不足并向著這些方向不斷努力，相信定會(huì)逐步提升檢測(cè)靈敏度和化合物覆蓋范圍，也勢(shì)必會(huì)迅速擴(kuò)充現(xiàn)有資源，不短突破新的認(rèn)知。而現(xiàn)代醫(yī)藥研究所貫徹的“單靶標(biāo)、單疾病、單藥物”研究模式正面臨耗費(fèi)巨大、成功率低的困境，這為中藥的發(fā)展提供了新的契機(jī)和挑戰(zhàn)。如何將中藥用科學(xué)的、現(xiàn)代的語(yǔ)言進(jìn)行闡釋，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，弄清其作用機(jī)制，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國(guó)際化所亟待解決的問(wèn)題。將代謝組學(xué)系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)應(yīng)用于中藥研究，在科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新的基礎(chǔ)上又能融合中醫(yī)藥辨證施治、整體調(diào)節(jié)、陰陽(yáng)調(diào)和等傳統(tǒng)特點(diǎn)，將大力推進(jìn)中藥現(xiàn)代化發(fā)展，形成一條具有特色的中藥新藥研發(fā)之路。