細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的中藥代謝激活與毒性研究進(jìn)展＊

吳敬敬，馬虹瑩，王丹丹，葛廣波＊＊，楊 凌＊＊

（1.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 大連 116044；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院 上海 201203）

中草藥以其獨特的療效在中國乃至世界的醫(yī)療保障體系中占有非常重要的地位。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，大約世界人口的80%都在使用草藥作為治療手段[1]。然而，近年來，有關(guān)中草藥誘發(fā)毒性的報道日趨增多，使中草藥安全性問題成為醫(yī)患及社會共同關(guān)注的焦點[2-4]。中草藥毒性主要分為直接毒性和草藥-藥物相互作用兩大類。藥物代謝是人體防御外來物侵襲的重要機制。一般而言，外源性物質(zhì)通過代謝反應(yīng)會使母體化合物的生物活性或毒性有所降低，所以被認(rèn)為是減毒的過程。然而，也有相當(dāng)一部分藥物分子經(jīng)代謝會生成毒性更強的代謝物。在有些情況下，甚至?xí)诖x酶的催化作用下產(chǎn)生親電反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物，這個過程被稱為代謝激活（metabolic activation）或生物激活（bioactivation）（圖1）。目前報道的絕大多數(shù)的代謝激活是由細(xì)胞色素P450酶所介導(dǎo)的，僅有少數(shù)由尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、磺酸化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等介導(dǎo)[5-7]。代謝激活過程中產(chǎn)生的具有親電活性的代謝中間體，一方面能夠和細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)或核酸，發(fā)生共價結(jié)合而誘發(fā)毒性；另一方面還會共價修飾藥物代謝酶，使其產(chǎn)生不可逆性抑制，從而誘發(fā)嚴(yán)重的藥物-藥物相互作用[8,9]。代謝激活是藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）和上市藥物被撤銷的主要原因[10-13]。統(tǒng)計表明，在美國已撤市的藥物中有64%的藥物經(jīng)歷了代謝激活過程[14,15]。目前，代謝激活已經(jīng)成為了國內(nèi)外中草藥毒性研究領(lǐng)域的熱點，尤其是近期馬兜鈴酸致肝癌的相關(guān)性研究使得中藥安全性再度成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點問題[16]。

圖1 代謝激活的基本過程模式圖

表1 易被P450酶代謝激活的基團(tuán)和相應(yīng)產(chǎn)生的活性代謝中間體

早在2005年，Kalgutkar等人根據(jù)大量的實驗結(jié)果總結(jié)了容易被代謝激活的毒性基團(tuán)[17]（表1）。其中主要包括：芳香胺、酰肼類、芳香硝基物、含氮雜環(huán)化合物、對苯二酚、亞甲二氧基苯、呋喃等。Samuel等人發(fā)現(xiàn)一個含有苯氧基的候選藥物在藥物代謝酶的催化作用下會發(fā)生很強的代謝激活生成臨醌親電活性中間體，并對其作了一系列的結(jié)構(gòu)修飾，最終大大降低了其代謝激活的程度[18]。Tang等人發(fā)現(xiàn)含有二氨基吡啶基團(tuán)的化合物很容易經(jīng)歷代謝激活過程，從而形成醌亞胺親電活性中間體。經(jīng)過大量的化學(xué)修飾改造發(fā)現(xiàn)用N-甲基或者氧替換吡啶環(huán)上的2-NH基團(tuán)能夠在不影響藥效的情況下消除代謝激活的現(xiàn)象[19]。本文將針對P450酶代謝激活的不同中藥化合物及其相關(guān)毒性進(jìn)行綜述。

1 吡咯里西啶類

圖2 吡咯里西啶生物堿的代謝激活過程

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類天然有毒生物堿，據(jù)統(tǒng)計大約有400種結(jié)構(gòu)得到確證的PAs，廣泛存在于6000種有花植物中。這些植物的95%以上主要集中于以下4個科中即菊科（Asteraceae）的千里光屬（Senecio L.）、橐吾屬（Ligularia Cass）、澤蘭屬（Eupatorium）和蜂斗菜屬（Petasites）；紫草科（Boraginaceae）的天芥菜屬（Heliotropium）、琉璃草屬（Cynoglossum）、紫草屬（Lithospermum）和聚合草屬（Symphytum）；豆科（Leguminosae）的豬屎豆屬（Crotalaria）；蘭 科（Orchidaceae）的 羊 耳 蒜 屬（Liparis）。吡咯里西啶生物堿的代謝激活反應(yīng)被認(rèn)為是其毒性產(chǎn)生的一個非常重要的誘因，其經(jīng)由P450代謝轉(zhuǎn)化形成吡咯-蛋白質(zhì)加合物，從而誘發(fā)肝毒性，這些加合物可作為評價PAs毒性的生物標(biāo)志物[20]。

肝臟中多種藥物代謝酶都參與了吡咯里西啶生物堿的代謝反應(yīng)，其中細(xì)胞色素P450參與的代謝激活反應(yīng)被認(rèn)為是其致毒的一個關(guān)鍵的步驟[21]。吡咯里西啶類生物堿的發(fā)現(xiàn)解釋了千里光、款冬花等中藥發(fā)生肝毒性的原因[22]。不同的PAs毒性差別很大。PAs是千里光次堿酸的單酯或二酯，根據(jù)堿基類型可分為3種類型：倒千里光裂堿型（retronecine-type），奧索千里光裂堿型（otonecine-type）和闊葉千里光裂堿型（platynecine-type）。其中，毒性最弱的是闊葉千里光裂堿型的PAs[20]，具有肝毒性的PAs含有不飽和的堿基[21]。PAs通過P450酶代謝轉(zhuǎn)化形成吡咯-蛋白質(zhì)加合物的活性中間體，從而誘發(fā)肝毒性（圖2）。已有研究表明，僅有CYP3A4和CYP3A5兩種P450亞型酶能夠激活奧索千里光裂堿型PA；相比之下，CYP1A1，1A2，2A6，3A4，3A5，2B6，2C9，2C19，2D6，2E1等10余種P450亞型酶均能夠激活倒千里光裂堿型PA，并且參與其代謝激活的P450亞型酶的貢獻(xiàn)也存在很大差異[21]。此外，值得注意的是，N-葡萄糖醛酸化是大多數(shù)吡咯里西啶生物堿的一條共有的代謝途徑，且主要由尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）1A4介導(dǎo)。已有研究表明，單獨使用千里光寧（senecionine）并不能誘發(fā)人肝細(xì)胞毒性，而當(dāng)UGT1A4活性受到蕃麻皂抑制后，肝細(xì)胞毒性迅速表現(xiàn)出來，這表明葡糖醛酸化可能是人體抵御其毒性一道重要防御機制[23,24]。

2 硝基菲類

馬兜鈴酸（aristolochic acid）屬硝基菲類衍生物，是關(guān)木通、廣防己等馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的有效成分，曾在臨床上用于鎮(zhèn)痛消炎、祛痰利尿以及感染性疾病和癌癥的輔助用藥等，從結(jié)構(gòu)上分為馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II，均含有硝基芳烴結(jié)構(gòu)[25]。已有研究表明，馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)中的硝基基團(tuán)為主要的毒性基團(tuán)，甲基和羥基的存在可以進(jìn)一步增強其毒性[26,27]。馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II能夠在CYP1A1/2等多種代謝酶的作用下，硝基基團(tuán)被還原成環(huán)狀的成氮翁離子（nitrenium），后者可以與DNA，尤其是鳥嘌呤和腺嘌呤的氨基基團(tuán)，或者蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，形成加合物，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死[28-30]。1993年，比利時學(xué)者在Lancet雜志上首次報道了含有廣防己和厚樸的減肥丸可引起快速進(jìn)行性間質(zhì)性腎纖維化，并稱此腎病為中草藥腎病[31]。1999年英國柳葉刀又報道了兩名婦女因服用含關(guān)木通的草藥茶治療濕疹導(dǎo)致晚期腎衰竭事件[32]。2000年6月美國聯(lián)邦食品藥物管理局（FDA）采取了嚴(yán)厲措施，對含馬兜鈴酸成分的藥材和成藥限制使用和進(jìn)口。隨后加拿大、英國、西班牙、馬來西亞等國家也發(fā)布了進(jìn)口和銷售含馬兜鈴中藥的禁令。國家藥品和監(jiān)督管理局于2003年4月1日印發(fā)了取消關(guān)木通藥用標(biāo)識的通知。

表2 吡咯里西啶類中草藥的代謝激活實例

表3 硝基菲類中草藥的代謝激活實例

表4 亞甲二氧基苯類中草藥的代謝激活實例

續(xù)表

圖3 EEA的代謝激活過程

3 亞甲二氧基苯

天然產(chǎn)物中廣泛分布有亞甲二氧基苯化合物[33]。例如，體外研究報道證實紫堇靈（corynoline）[34]，五味子酯甲（schisantherin A）[35]和黃連堿（hydrastine）[36]等含有亞甲二氧基苯結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物均對P450酶表現(xiàn)出NADPH和時間依賴性的抑制作用。那可?。∟oscapine）是從罌粟科植物中分離得到的一種芐基異喹啉類生物堿，長期以來在臨床上用作鎮(zhèn)咳藥[37]。該化合物含有亞甲二氧基苯結(jié)構(gòu)。已有研究表明，那可丁對CYP3A4和CYP2C9表現(xiàn)出NADPH和時間依賴性的抑制作用，這可能是臨床上發(fā)生那可丁-華法林聯(lián)合用藥所致的華法林不良反應(yīng)的重要機制[38]。黃樟油精（Safrole）是黃樟、肉桂和胡椒等植物的主要成分，其已經(jīng)被證明有肝毒性和肝致癌性的潛在風(fēng)險[39]。長期使用黃樟油精1年或更長時間會導(dǎo)致大鼠和小鼠肝癌。黃樟油精在體內(nèi)主要由CYP2A6，CYP2C9，CYP2D6和CYP2E1等P450酶生成1'-羥基黃樟油精，然后進(jìn)一步與磺基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合形成可致癌作用的綴合物[40,41]。此外，卡瓦（Kava）是一種用于治療焦慮和失眠的草藥，醉人素（Methysticin）和二氫麻醉椒素（dihydromethysticin）是其中含有亞甲二氧基苯結(jié)構(gòu)的兩種卡瓦內(nèi)酯，可經(jīng)由P450酶介導(dǎo)的O-脫烷基化反應(yīng)形成鄰苯二酚，并進(jìn)一步氧化生成親電子的鄰醌，后者會消耗細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽，這可能是卡瓦導(dǎo)致肝毒性的潛在機制[42,43]。

4 呋喃類

越來越多的證據(jù)表明含有共同呋喃環(huán)的化合物與藥物小分子的毒性和與藥代動力學(xué)相互作用有關(guān)。石蠶是一種具有利膽和抗菌作用的民間藥物，石蠶堿（Teucrin A）被認(rèn)為是石蠶造成肝毒性的罪魁禍?zhǔn)祝摶衔锏倪秽h(huán)經(jīng)CYP3A4介導(dǎo)的氧化反應(yīng)生成反應(yīng)性環(huán)氧化物，進(jìn)而與環(huán)氧化物羥化酶形成加合物，導(dǎo)致自身抗體的形成，并誘發(fā)免疫反應(yīng)[44]。8-甲氧基補骨脂素可聯(lián)合長波長紫外線治療銀屑病，有研究表明8-MOP可經(jīng)由CYP2A6和CYP2B1代謝激活生成活性中間體，進(jìn)一步與GSH或大分子共價結(jié)合形成呋喃環(huán)氧化物[45,46]。檸檬苦素（Limonin），是一種從許多柑橘類水果如吳茱萸果實中提取的檸檬苦素衍生物，以NADPH-和時間依賴性方式使CYP3A4失活。推測呋喃環(huán)的生物活化形成的反應(yīng)性中間體是檸檬苦素使CYP3A4失活的主要原因[47]。薄荷呋喃（Menthofuran），一種天然存在的肝毒素，可被P450酶氧化為反應(yīng)性親電子體，這與薄荷呋喃肝臟毒性機制相關(guān)。參與這一過程的CYP亞型包括CYP1A2，CYP2E1、CYP2C19和CYP2A6[48]。薄荷呋喃也是胡薄荷酮（pulegone）的代謝產(chǎn)物，這可能也是胡薄荷酮產(chǎn)生毒性的原因之一[49]。

表5 呋喃類中草藥的代謝激活實例

表6 烯烴類中草藥的代謝激活實例

表7 蒽醌類中草藥的代謝激活實例

表8 吲哚類中草藥的代謝激活實例

此外，呋喃型化合物8-表黃藥子素E乙酸酯（EEA）是中藥黃藥子的主要組成成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠喂服EEA可引發(fā)急性肝毒性。研究者進(jìn)一步通過體內(nèi)外的代謝激活實驗發(fā)現(xiàn)CYP3A4是EEA的主要代謝酶，催化EEA生成烯二醇活性中間體（圖3），這可能是其導(dǎo)致肝毒性的主要發(fā)生機理[50,51]。此外，活性代謝產(chǎn)物生成后，一方面可以共價修飾P450酶，人血清白蛋白等大分子蛋白，產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)免疫毒性；另一方面也可能會進(jìn)攻DNA后產(chǎn)生DNA加合物，進(jìn)而引發(fā)遺傳毒性。

5 烯烴類

烯烴是藥物中典型的毒素。草蒿素（Estragole）和甲基丁香酚（methyleugenol）存在于多種中草藥中，如肉豆蔻，肉桂，龍蒿，羅勒，茴香，茴香等。已有研究表明草蒿素具有遺傳毒性和致癌性，且與其生物轉(zhuǎn)化相關(guān)。草蒿素通過CYP1A2和CYP2A6代謝形成1'-羥基草蒿素[52]，后者進(jìn)一步發(fā)生硫酸化反應(yīng)，形成1'-磺氧基草蒿素，這是一種潛在的致癌物。失去硫酸基團(tuán)的同時，生成的草蒿素碳正離子能夠與DNA（主要是脫氧鳥苷）生成加合物[53]。與草蒿素相似，甲基丁香酚在體內(nèi)經(jīng)由CYP1A2和CYP2C9代謝生成1'-羥甲基丁烯醇，后者是一種致癌代謝物，可促進(jìn)小鼠和大鼠腫瘤的形成[54]。此外，大蒜素（Allicin）是一種從大蒜中分離出來的有機硫化合物，據(jù)報道它具有抗細(xì)菌和抗真菌作用。該化合物可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為二烯丙基硫醚化合物，然后通過CYP2E1將其轉(zhuǎn)化為二烯丙基砜，二烯丙基砜通過生物轉(zhuǎn)化形成活性單烯丙基環(huán)氧化物，進(jìn)一步與CYP2E1形成加合物，最終導(dǎo)致不可逆的酶抑制作用，從而滅活CYP2E1的活性[55-57]。

6 蒽醌類

何首烏是一種常用中藥材，其引發(fā)的DILI不良反應(yīng)報道逐年增多[58,59]。何首烏引發(fā)的肝損傷占全部藥物性肝損傷病例的3.24%[60]。2012年9月美國國家醫(yī)學(xué)圖書館發(fā)布的LiverTox數(shù)據(jù)庫中收錄600余種具有肝毒性的西藥和中草藥，其中何首烏作為一個專題被收錄，較系統(tǒng)綜述了何首烏及其制劑肝損傷的國際報道[61]；國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心2014年7月19日第61期藥品不良反應(yīng)信息通報特別報道了口服何首烏及其成方制劑存在肝損傷風(fēng)險[62]。已有研究者對何首烏的部分主要單體成分進(jìn)行了體外毒性評價，其結(jié)果雖然顯示其主要成分蒽醌類化合物，如大黃素、大黃酸、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素和沒食子酸會對肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷[59,63]。其中，大黃素在體內(nèi)主要經(jīng)由CYP1A2，CYP2C19和CYP3A4代謝生成氧化產(chǎn)物，大黃素及其氧化產(chǎn)物均能與谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸等生物硫醇形成加合物，這可能是其誘發(fā)肝毒性的主要機制[64]。

7 吲哚類

許多含有吲哚基團(tuán)的藥物分子被證明通過生物活化形成醌亞胺中間體。吳茱萸次堿（Rutaecarpine）和吳茱萸堿（evodiamine）是從吳茱萸中分離得到的兩種吲哚-喹唑啉類生物堿。吳茱萸次堿對CYP3A4可產(chǎn)生NADPH-和時間依賴性的抑制作用，發(fā)揮其生物活性。相反，吳茱萸堿雖然與吳茱萸次堿具有相似的結(jié)構(gòu)，但卻不能滅活CYP3A4[47]。

8 展望

綜上所述，代謝激活可作為引發(fā)中草藥毒性的重要起始事件。早期篩查和評價中藥組份的代謝激活潛能是中藥毒性評價的重要組成部分，可借助質(zhì)譜技術(shù)，采用產(chǎn)物離子掃描、中性丟失掃描等質(zhì)譜手段，結(jié)合Lightsight等先進(jìn)的質(zhì)譜解析軟件，監(jiān)測反應(yīng)性代謝物及其加合物結(jié)合物的特征質(zhì)譜信號，篩查毒性成分；進(jìn)而對其肝毒性等下游毒性事件進(jìn)行驗證評價。目前，國際毒理學(xué)界提出了有害結(jié)局路徑（Adverse Outcome Pathway，AOP）這一框架，該框架是目前國際上公認(rèn)的毒理學(xué)評價體系，其核心是在系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)下，基于毒物作用模式（Mode of Action,MoA）[65]，將分子起始事件（Molecular Initiating Events，MIEs）至 有 害 結(jié) 局（Adverse Outcome，AO）中所有與毒性相關(guān)的關(guān)鍵事件（Key Events，KEs）的信息逐層整合并構(gòu)建在不同層面的生物體系上，如分子、亞細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、器官等水平，進(jìn)而用于毒物的風(fēng)險評估與分類[66,67]。在AOP框架下，毒性評價可借助不同種類的細(xì)胞/組織/動物等體內(nèi)外模型，并結(jié)合各種檢測和評價手段，取決于應(yīng)用目的的不同。毒性相關(guān)的分子改變、形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、功能改變等都須與起始事件及一系列中間事件，包括分子機制，可以依照特定的體系或應(yīng)用目標(biāo)邏輯性關(guān)聯(lián)起來。該框架可在評價化合物是否有害的同時對化合物進(jìn)行分類，還可依據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)以及作用模式和機制預(yù)估新化合物的毒性及潛在機制。