間接免疫熒光試驗檢測抗核抗體的前帶效應(yīng)分析

胡瓊文，胡朝軍，李 萍，鄧垂文，吳子燕，曾小峰，張奉春，廖 璞，李永哲，張蜀瀾△

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科，北京100032；2.重慶市人民醫(yī)院三院院區(qū)檢驗科/重慶市臨床檢驗中心，重慶400014)

抗核抗體(ANA)是自身免疫性疾病(AID)非常重要的血清自身抗體，歐洲自身免疫標準化促進會(EASI)推薦ANA作為AID診斷的必要檢測項目[1]。ANA檢測已被納入了一些AID如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、未分化結(jié)締組織病、原發(fā)性干燥綜合征的診斷指南[2-4]。目前，以HEP-2細胞為基質(zhì)的間接免疫熒光試驗(IIFA)仍然被美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)、EASI、中國免疫學(xué)會臨床免疫分會等專業(yè)學(xué)會推薦為ANA檢測的“參考方法”[1,5-6]。ANA檢測結(jié)果推薦以滴度值表示，即陽性血清恰好呈陽性反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)[6]。IIFA檢測ANA的熒光滴度越高，患者與AID的相關(guān)性越大，而低滴度的ANA可見于其他非AID患者甚至健康人群[1,6]。因此，IIFA檢測ANA熒光滴度的準確性對于AID患者的診斷尤為重要。然而，目前國內(nèi)外尚無研究報道IIFA檢測ANA中的前帶效應(yīng)對ANA熒光滴度的影響。本研究通過對43例高濃度ANA血清樣本倍比稀釋實驗，探討IIFA檢測ANA中的前帶效應(yīng)對ANA熒光滴度的影響，從而盡可能避免前帶效應(yīng)對高滴度標本的影響。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫實驗室2018年2月26日至2018年2月28日常規(guī)檢測ANA的880例新鮮血清樣本。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 歐蒙Sprinter XL全自動熒光加樣儀、EUROPattern全自動熒光分析儀、EUROStar Ⅲ Plus歐蒙之星熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)、歐蒙EUROLineMaster Plus全自動免疫印跡儀、TECAN-sunrise酶標儀、Thermo洗板機、10～100 μL加樣槍。

1.2.2試劑 德國歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國)有限公司提供的成套商品試劑盒：ANA IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)、ANA譜(IgG)檢測試劑盒(歐蒙印跡法)、抗dsDNA(dsDNA)抗體IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)、抗dsDNA抗體(IgG)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒。

1.3方法

1.3.1ANA檢測 將880例血清樣本以1∶100稀釋進行手工檢測，操作步驟按ANA IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)說明書進行。在熒光顯微鏡下觀察熒光模型及熒光滴度，根據(jù)試劑盒說明書的滴度判斷標準及陽性判斷標準(熒光滴度≥1∶100判為陽性)進行結(jié)果判斷，并統(tǒng)計ANA陽性樣本數(shù)量和高ANA滴度(≥1∶1 000)樣本數(shù)量。

1.3.2有前帶效應(yīng)的樣本篩選 將上述檢測的高ANA滴度 (≥1∶1 000)樣本分別以1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋進行手工檢測，步驟按ANA IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)說明書進行。在熒光顯微鏡下觀察熒光模型及熒光滴度，根據(jù)《臨床免疫學(xué)與檢驗》等全國高等學(xué)校教材中前帶效應(yīng)的定義，本研究將1∶1 000稀釋后熒光亮度反而比1∶100稀釋后熒光亮度更強的樣本定義為有前帶效應(yīng)的樣本，并選取熒光片的中央?yún)^(qū)域(×400)拍照保存。將有前帶效應(yīng)的樣本采用歐蒙Sprinter XL全自動熒光加樣儀和EUROPattern全自動熒光分析儀檢測ANA(1∶100稀釋)，與手工法檢測ANA(1∶100稀釋)進行比較，并選取熒光片的中央?yún)^(qū)域和邊角區(qū)域(×200)拍照保存。

1.3.3特異性自身抗體檢測 選取上述有前帶效應(yīng)的血清樣本43例，采用ANA譜(IgG)檢測試劑盒(歐蒙印跡法)檢測其的特異性自身抗體，抗dsDNA-IgG抗體采用IIFA與ELISA同時檢測。

2 結(jié) 果

2.1前帶效應(yīng)樣本分析 檢測ANA的880例血清樣本中，ANA陽性(滴度≥1∶100)樣本數(shù)為492例(55.91%)，高ANA滴度 (≥1∶1 000)樣本數(shù)為115例(13.07%)。將高ANA滴度(≥1∶1 000)的樣本分別以1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋進行手工檢測，在熒光顯微鏡下觀察其是否存在前帶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)有前帶效應(yīng)的樣本(1∶1 000稀釋比1∶100稀釋熒光亮度更強)數(shù)為34例，占總樣本數(shù)的3.86%，占高滴度ANA樣本(≥1∶1 000)數(shù)的29.57%。前帶效應(yīng)的鏡下結(jié)果見圖1，可以發(fā)現(xiàn)其熒光亮度隨著血清樣本稀釋度的增加而增強。

2.2手工與Sprinter XL檢測對比 將有前帶效應(yīng)的樣本采用歐蒙Sprinter XL全自動熒光加樣儀和EUROPattern全自動熒光分析儀檢測ANA(1∶100稀釋)，與手工法檢測ANA(1∶100稀釋)進行比較，手工檢測和歐蒙Sprinter XL全自動熒光加樣儀檢測其熒光模型及熒光滴度相似，在1∶100稀釋度時均存在邊緣區(qū)域熒光亮中間區(qū)域熒光暗的情形，值得注意的是，EUROPattern全自動熒光分析儀判讀只能選取圖片中間區(qū)域拍照判讀。見圖2。

注：6號、14號、19號樣本分別以1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋

圖1 ANA熒光滴度對比圖(×400)

注：A為EUROPattern全自動熒光分析儀檢測；B為手工檢測

圖2手工檢測與歐蒙Sprinter XL全自動熒光加樣儀和EUROPattern全自動熒光分析儀檢測ANA的熒光對比圖(×200)

2.3特異性自身抗體分析 選取43例有前帶效應(yīng)的血清樣本檢測其特異性自身抗體，分析其熒光模型、熒光滴度及陽性特異性自身抗體的分布特點。所有43例前帶效應(yīng)的血清樣本熒光滴度均≥1∶3 200，其中，以熒光滴度≥1∶10 000最常見(74.42%)。而在熒光模型方面，以核斑點型最為多見(46.51%)。在特異性自身抗體的分布方面，以抗核糖核蛋白(RNP)抗體最多見(62.79%)，其次為抗dsDNA-IgG抗體(51.16%)和抗SSA抗體(51.16%)。見表1、2。

表1 有前帶效應(yīng)的43例血清樣本熒光模型與熒光滴度分布

表2 有前帶效應(yīng)的43例血清樣本陽性特異性抗體分布

注：dsDNA為抗dsDNA抗體；Sm為抗Sm抗體；RNP為抗RNP抗體；SSA為抗SSA抗體；SSB為抗SSB抗體；rRNP為抗核糖體抗體；AHA為抗組蛋白抗體；Ro52為抗Ro52抗體；ANuA為抗核小體抗體；AMA(M2)為抗線粒體M2型抗體；Jo-1為抗組氨酰-tRNA合成酶抗體

3 討 論

20世紀初免疫學(xué)家發(fā)現(xiàn)在抗原抗體反應(yīng)中，抗體數(shù)量的增加反而會減少抗原抗體復(fù)合物沉淀數(shù)量。之后，人們觀察到有一個超出最佳抗原抗體反應(yīng)濃度的抗體濃度范圍是無效的，并將其稱為“前帶”，這個相關(guān)的現(xiàn)象被稱為前帶效應(yīng)或鉤狀效應(yīng)[7-8]。前帶效應(yīng)是生物化學(xué)復(fù)合物形成中存在的普遍現(xiàn)象，它通常發(fā)生在雙位點免疫測定中，即當(dāng)一種蛋白質(zhì)在免疫復(fù)合物中起“橋接”作用時[8-9]。目前，免疫比濁法、化學(xué)發(fā)光法、液相芯片法、凝集法等各類免疫測定方法均有前帶效應(yīng)的報道[10-13]。然而，IIFA中的前帶效應(yīng)國內(nèi)外尚鮮有研究報道。

本研究將1∶1 000稀釋比1∶100稀釋熒光亮的樣本判為有明顯前帶效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有明顯前帶效應(yīng)的樣本數(shù)占高滴度ANA樣本(≥1∶1 000)的29.57%，說明前帶效應(yīng)在高滴度ANA樣本中發(fā)生率不低，應(yīng)得到檢驗工作人員的重視。本研究觀察到有明顯前帶效應(yīng)的血清樣本采用手工法檢測與全自動熒光加樣儀檢測，其熒光模型及熒光滴度均無差別，且它們均存在邊緣區(qū)域熒光亮中間區(qū)域熒光暗的情形，這種“邊緣現(xiàn)象”在抗體濃度高的1∶100稀釋時最明顯，隨著血清樣本稀釋比例增加而逐漸減弱?！斑吘壃F(xiàn)象”產(chǎn)生的原因不清楚，但應(yīng)該不是因為血清或酶標二抗孵育過程中壓片或接觸不良所致，因為采用歐蒙Sprinter XL全自動熒光加樣儀檢測是將生物薄片朝上平放，血清或酶標二抗直接滴于生物薄片表面，液滴上無任何覆蓋，不存在擠壓問題。分析43例前帶效應(yīng)的血清樣本熒光模型、熒光滴度及陽性特異性自身抗體的分布特點發(fā)現(xiàn)，有前帶效應(yīng)的血清樣本熒光滴度均≥1∶3 200，其中，熒光滴度≥1∶10 000的占74.42%，說明ANA熒光滴度越高越容易發(fā)生前帶效應(yīng)。熒光模型以核斑點型最多見(46.51%)，陽性特異性自身抗體以抗RNP抗體最多見(62.79%)，可能因為核斑點型與抗RNP抗體容易出現(xiàn)高滴度陽性，未發(fā)現(xiàn)前帶效應(yīng)與熒光模型及陽性特異性自身抗體種類具有相關(guān)性。

由于經(jīng)濟水平限制，國內(nèi)大多數(shù)實驗室ANA-IIFA檢測時僅做起始稀釋度，根據(jù)熒光強度粗略判斷滴度，而不進一步稀釋。由于前帶現(xiàn)象存在，可能導(dǎo)致強陽性的結(jié)果誤報為中等陽性結(jié)果，甚至弱陽性結(jié)果，最終影響患者的及時準確的診斷和治療。在人工判讀時，觀察視野比較完整，有經(jīng)驗的工作人員可根據(jù)熒光基質(zhì)片中部和邊緣染色不均一，判斷可能存在前帶現(xiàn)象，通過進一步稀釋來確認，從而避免前帶現(xiàn)象對滴度判讀的干擾。雖然MELEGARI等[14]的研究表明，人眼判讀ANA-IIFA與AKLIDES自動判讀系統(tǒng)判讀相比具有高達98.9%的一致性，但是，對于具有前帶效應(yīng)的樣本，由于儀器選取視野的局限性，采集的圖像可能位于熒光基質(zhì)片中部，當(dāng)工作人員通過儀器采集圖片確認結(jié)果時，誤判滴度的可能性就大大增加。因此，了解前帶現(xiàn)象對于ANA-IIFA檢測的影響具有重要價值。

4 結(jié) 論

IIFA檢測高滴度ANA樣本在低稀釋度時容易產(chǎn)生前帶效應(yīng)，從而導(dǎo)致錯誤的ANA熒光滴度判斷，臨床檢驗實驗室應(yīng)引起重視。