血清miR-210和miR-375在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)變化情況

肖 灑，蔡 宙，鐘欣超，李玉嬋，吳科鋒，孫 杰，李文德，黃 韌，鄧少嫦△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣東湛江 524023；3.廣州市外顯子生物技術(shù)有限公司,廣東廣州 510663；4.廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤二科,廣東廣州 510663；5.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所/廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510663)

肺癌已成為全球腫瘤死亡的主要原因之一[1]。據(jù)中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告，截至2015年，中國共出現(xiàn)有430萬癌癥病例，且死亡病例數(shù)超過281萬，其中，肺癌的死亡人數(shù)超過所有死亡人數(shù)的21%[2]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞未分化癌[3]。NSCLC的癌細(xì)胞生長分裂較慢，且擴(kuò)散轉(zhuǎn)移也比較晚，大部分肺癌患者確診時(shí)已為中晚期。因此，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物是降低肺癌患者死亡率的關(guān)鍵[4-5]。

微小RNA(miRNA)是真核生物中一類長度約為22 nt的非編碼小分子單鏈RNA。研究表明，miRNA通過與靶mRNA 3′非編碼區(qū)(3′UTR)完全或不完全結(jié)合，抑制其靶mRNA翻譯或直接誘導(dǎo)其降解，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[6-7]。大量研究表明，miRNA參與機(jī)體多種生理和病理過程[8-10]，且可通過調(diào)控其靶基因參與信號(hào)通路調(diào)控，并參與肺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[11-13]。

miRNA廣泛存在于各種體液中，血清就是其中之一。MOTAWI 等[14]報(bào)道，循環(huán)miRNA在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后判斷中起重要調(diào)節(jié)作用，可成為早期診斷標(biāo)志物。但是，循環(huán)miRNA在肺癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中的作用還有待于深入研究。朱利群等[15]報(bào)道，NSCLC患者血清miRNA-200b表達(dá)水平顯著上升，有可能成為新型的肺癌標(biāo)志物，作為無創(chuàng)早期診斷NSCLC的指標(biāo)之一。SUN等[16]通過對(duì)比60例NSCLC患者和30例健康人的血清miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-210表達(dá)升高可作為NSCLC診斷依據(jù)，且通過36例接受過3次左右鉑類化療的NSCLC晚期患者的療效發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定疾病進(jìn)展組比局部緩解組患者血清miR-210表達(dá)更高，提示miR-210可在肺癌治療中起到治療反饋?zhàn)饔?。HALVORSEN 等[17]通過聯(lián)合6個(gè)外周血miRNA(miR-429、miR-205、miR-200b、miR-203、miR-125b和miR-34b)可區(qū)分早期NSCLC患者、慢性阻塞性肺疾病患者和健康體檢者，且它們?cè)\斷NSCLC患者的曲線下面積(AUC)為0.89。因此多個(gè)miRNA聯(lián)合檢測(cè)有助于提高肺癌的靈敏度和早期診斷率。本研究選取9個(gè)已經(jīng)報(bào)道過在肺癌患者血清中差異表達(dá)的miRNA (miR-182、miR-126、miR-31、miR-21、miR-221、miR-200b、miR-183、miR-210、miR-375)，作為研究目標(biāo)，通過初篩和進(jìn)一步確認(rèn)發(fā)現(xiàn)，miR-210在肺腺癌中顯著上調(diào)，可作為肺腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和廣東省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科2016年3-12月確診的NSCLC患者25例(NSCLC組)，其中男14例，女11例；年齡39～83歲，平均66.0歲；肺腺癌13例(肺腺癌組)，鱗癌12例(肺鱗癌組)；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期3例，Ⅲ、Ⅳ期22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)NSCLC均經(jīng)病理學(xué)確診，符合美國胸科醫(yī)生學(xué)會(huì)(ACCP)肺癌診治標(biāo)準(zhǔn)[18]；(2)按美國聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)(AJCC)和國際癌癥研究協(xié)會(huì)(IASLC)2009 年制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第7版)進(jìn)行分期[19]；(3)具備完整的臨床診斷、治療資料；(4)獲得標(biāo)本前患者未經(jīng)過放療、化療等治療；(5)吸煙者定義為吸煙總數(shù)超過100支。以上患者均按照世界衛(wèi)生組織(WHO)肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。另選擇健康志愿者14例作為對(duì)照組，其中男10例，女4例；年齡17～71歲，平均53.5歲；無高血壓、高血脂、糖尿病等基礎(chǔ)性疾病。所有標(biāo)本采集均獲得患者及主管醫(yī)生同意，且所有參與者均簽訂知情同意書。

1.2儀器與試劑 Applied Biosystems 7500 熒光定量PCR儀購自ABI公司；Trizol試劑購自Life Technology公司；RTase M-MLV(RNase H-)試劑購自TAKARA公司；熒光定量 PCR試劑盒購自Vazyme公司；引物設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理 空腹抽取1～3 mL外周靜脈血置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，在室溫條件下，4 000 r/min離心5 min，取最上層0.2～0.5 mL血清至無菌凍存管。

1.3.2血清總RNA提取 采用Trizol法提取血清總RNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的A260/A280及RNA濃度。RNA的A260/A280在1.8～2.1時(shí)，判斷其純度合格。

1.3.3miRNA逆轉(zhuǎn)錄 miRNA逆轉(zhuǎn)錄參照RTase M-MLV (RNase H-)試劑說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：RNA 1.0 μg，Olig(dT)18 0.5 μL，隨機(jī)引物 0.5 μL加入RNase free ddH2O至12 μL，70 ℃ 10 min后迅速冷卻1 min；然后加入10 mmol/L dNTP Mixture 0.5 μL、RNase inhibitor (40 U/μL) 0.25 μL、5×M-MLV buffer 4.0 μL、RTase M-MLV(RNase H-) 0.5 μL，加入RNase free ddH2O至20 μL，混勻后42 ℃恒溫60 min，72 ℃滅活15 min，最后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA 2 μL，正、反向引物各0.5 μL，AceQTMqPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1血清中與肺癌相關(guān)的miRNA 通過PubMed、萬方和知網(wǎng)等文獻(xiàn)搜索引擎，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)在肺癌患者血清中差異表達(dá)的miRNA，將這9個(gè)miRNA作為研究目標(biāo)，探討其對(duì)肺癌的臨床診斷價(jià)值。見表2。

2.2血清中總RNA分析 采用Trizol法提取血清中總RNA，其A260/A280值均在合格范圍內(nèi)，RNA質(zhì)量濃度符合RT-qPCR的要求，見表3。

表2 血清中與肺癌相關(guān)的miRNA

注：SCLC為小細(xì)胞肺癌；↓表示miRNA表達(dá)下調(diào)；↑表示miRNA表達(dá)上調(diào)

注：A～I(xiàn)分別為miR-21、miR-31、miR-221、miR-126、miR-182、miR-200b、miR-183、miR-210、miR-375在血清中的相對(duì)表達(dá)情況

圖1 各miRNA在NSCLC組和對(duì)照組血清中的相對(duì)表達(dá)水平

注：N1～N6為健康人血清標(biāo)本；Ca1～Ca3為肺癌患者血清標(biāo)本

2.3miRNA PCR引物特異性驗(yàn)證 9種miRNA及內(nèi)參U6在內(nèi)共10種基因均成功擴(kuò)增出產(chǎn)物，且溶解曲線均為單峰，提示產(chǎn)物具有良好的特異性，引物設(shè)計(jì)成功。

2.4篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果 血清miR-210和miR-375在NSCLC組相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；而其余7種血清miRNA(miR-182、miR-126、miR-31、miR-21、miR-221、miR-200b、miR-183)相對(duì)表達(dá)量在NSCLC組與對(duì)照組的差異與文獻(xiàn)報(bào)道不符，見圖1。故選擇miR-210和miR-375進(jìn)行進(jìn)一步研究。

注:A為各組miR-210在血清中的相對(duì)表達(dá)水平，B為各組miR-375在血清中的相對(duì)表達(dá)水平

圖2 miR-210和miR-375分別在各組血清中的相對(duì)表達(dá)水平

2.5各組血清miR-210和miR-375的表達(dá)情況及其對(duì)于NSCLC的診斷價(jià)值 檢測(cè)19例NSCLC組患者(10例肺鱗癌和9例肺腺癌)與8例對(duì)照組血清中2種目標(biāo)miRNA(miR-210和miR-375)相對(duì)表達(dá)情況，見圖2。NSCLC組患者中，肺腺癌組血清中miR-210的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺鱗癌組患者血清miR-210較對(duì)照組有減少趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-375在肺鱗癌組和肺腺癌組患者血清中表達(dá)無差異，其原因需要進(jìn)一步探究。采用ROC曲線評(píng)價(jià)miR-210在肺腺癌診斷效能，其AUC為0.737 5(95%CI：0.498 3～0.976 7，P=0.091 4)，見圖3。

圖3 miR-210 對(duì)肺腺癌診斷的ROC曲線分析

3 討 論

由于肺癌存在高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)和對(duì)化療不敏感等特點(diǎn)，導(dǎo)致多數(shù)患者診斷時(shí)已屬于晚期并有轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病[28-29]。近年來，雖然肺癌診斷治療技術(shù)不斷提高，但是仍缺乏對(duì)肺癌早期診斷、治療、評(píng)估、預(yù)后判斷有效的生物學(xué)標(biāo)志[30]。因此，尋找新的、高靈敏度的肺癌早期診斷指標(biāo)具有重要臨床意義。

有研究表明，人體體液如血漿或血清中的循環(huán)miRNA可穩(wěn)定存在，獲得含有循環(huán)血miRNA的臨床標(biāo)本是簡(jiǎn)單非侵入的過程，且可通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其表達(dá)水平[27]；檢測(cè)到的血清或血漿循環(huán)miRNAs的表達(dá)譜中有許多種miRNA，可排除只檢測(cè)一種指標(biāo)而判定為假陽性的干擾，從而提高肺癌診斷的特異度、靈敏度和可信度。因此，循環(huán)血miRNA可成為有臨床價(jià)值的生物標(biāo)志物。

本研究在目標(biāo)miRNA的篩選過程中發(fā)現(xiàn)，7種與肺癌相關(guān)的miRNA表達(dá)水平與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致[31-32]，分析可能存在以下2種可能：(1)篩選實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)較少，不能完全反映出這7種miRNA在總體中的真實(shí)表達(dá)水平；(2)血清中miRNA來源復(fù)雜，miRNA組織特異性較差，且可能由其他組織釋放入血清導(dǎo)致這7種miRNA在血清中的真實(shí)表達(dá)情況被掩蓋了。

本研究結(jié)果顯示，血清miR-210的表達(dá)水平在肺腺癌患者中顯著上調(diào)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而，血清miR-210在肺鱗癌患者和對(duì)照組中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體原因還需進(jìn)一步研究。與對(duì)照組相比，血清miR-375在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究引入ROC曲線評(píng)價(jià)miR-210對(duì)肺腺癌患者的診斷效果，結(jié)果顯示，其AUC為0.737 5(95%CI：0.498 3～0.976 7)，說明其對(duì)肺腺癌的診斷具有中等效果。因此可推斷，血清miR-210有可能作為肺腺癌早期診斷的一個(gè)較好的輔助診斷指標(biāo)。

本研究也存在一些缺陷，比如標(biāo)本量小，未進(jìn)行進(jìn)一步的分子機(jī)制研究等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能具有一定局限性，但是該研究豐富了血清miR-210用于肺腺癌患者診斷、治療和預(yù)后的認(rèn)知。血清miR-210檢測(cè)用肺腺癌患者診斷需要擴(kuò)大樣本量，再進(jìn)行深入探討，以期對(duì)肺腺癌的診斷、監(jiān)測(cè)及治療發(fā)揮積極作用。

4 結(jié) 論

miR-210在肺腺癌患者中呈高表達(dá)，可成為診斷肺腺癌的新型腫瘤標(biāo)志物。對(duì)于如何探索檢測(cè)miR-210更精確的方法，做好質(zhì)量控制，以及將血清miR-210運(yùn)用于臨床肺腺癌的早期診斷，使其具有更高的準(zhǔn)確性等方面需要進(jìn)行更深入的研究。