基于化學(xué)計量學(xué)分析的訶子藥材高效液相色譜指紋圖譜研究＊

梁文儀，亓 旗，梁林金，葉 婷，周 坤，簡 平，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

訶子是使君子科欖仁樹屬植物訶子Terminalia chebular Retz.及其變種絨毛訶子Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果實[1]，又名訶黎勒，訶梨等，蒙藥名為“阿如拉”，泰語稱“麻菜果”，主要分布于我國西南等地區(qū)，如西藏、云南、廣東和廣西等。在藏醫(yī)蒙醫(yī)藥中應(yīng)用十分廣泛，有“藏藥之王”之稱[2]。臨床上用常于治療久瀉久痢，便血脫肛，肺虛喘咳，久嗽不止，咽痛音啞等癥[1，3]。訶子含有多酚類、黃酮類、多糖類、萜類和甾醇類等多種化學(xué)成分，其中含量最多的是鞣質(zhì)類，以可水解類鞣質(zhì)為主[4-6]。訶子具有廣泛的抑菌、抗病毒、保肝、抗炎、降血糖、調(diào)血脂、鎮(zhèn)咳和止痛等多種藥理作用[7-11]。

2015版《中國藥典》訶子藥材項下收載了其性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，但操作繁瑣，費時費力。相關(guān)學(xué)者對訶子藥材中沒食子酸、鞣花酸和莽草酸等成分進行了HPLC含量測定方法的建立[12-15]，以及HPLC指紋圖譜的建立[16，17]，但未對指紋圖譜中蘊含的大量信息進行深入分析，篩選區(qū)分不同品質(zhì)訶子的標志性成分。本實驗研究了10個不同來源訶子藥材HPLC指紋圖譜，采用系統(tǒng)聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）方法，挖掘指紋圖譜中蘊含的信息，考察不同來源訶子樣品的分類結(jié)果，尋找區(qū)分不同品質(zhì)訶子樣品的標志性成分，為訶子質(zhì)量控制及評價提供參考。

1 儀器與試藥

Sartorious BT 25S型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；LC-1100型高效液相色譜儀（安捷倫公司），DAD紫外檢測器；超聲波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W），AK-400A粉碎機（溫嶺市奧力中藥機械有限公司）。

表1 不同批次訶子藥材

對照品沒食子酸(MUST-17022801)、安石榴苷(MUST-17030501)、柯里拉京(MUST-17033002)、五沒食子酰葡萄糖(MUST-17060201)、鞣花酸(MUST-17052603)，純度均大于99%，購于成都曼斯特科技有限公司；沒食子酸甲酯（TN1127CA14），純度大于98%，購于上海源葉生物科技有限公司。

甲醇、磷酸（Fisher，色譜純）；屈臣氏純凈水；其余試劑均為分析純。

10個不同來源訶子樣品購自北京市藏醫(yī)院、安徽亳州藥材市場和河北安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系劉春生教授鑒定為訶子Terminalia chebular Retz.的干燥成熟果實。樣品來源(表1)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0-10 min，3%-6%B；10-25 min，6%-15%B；25-45 min，15%-20%B；45-50 min，20%-22%B；50-60 min，22%-30%B；60-70 min，30%-35%B；70-85 min，35%-37%B；85-90 min，37%-43%B；90-100 min，43%-45%B；100-105 min，45%-90%B。流速1 mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長270 nm，進樣量20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制

精密稱取沒食子酸、沒食子酸甲酯、安石榴苷、柯里拉京、五沒食子酰葡萄糖、鞣花酸適量，加50%甲醇于容量瓶定容，對照品溶液的質(zhì)量濃度分別為沒食子酸0.186 mg·mL-1，沒食子酸甲酯0.0096 mg·mL-1、安石榴苷0.182 mg·mL-1，柯里拉京0.0694 mg·mL-1，五沒食子酰葡萄糖0.324 mg·mL-1、鞣花酸0.1672 mg·mL-1，避光低溫保存。

2.2.2 訶子藥材供試品溶液配制

精密稱取0.2 g訶子藥材（過60目篩）置于100 mL錐形瓶，精密加入60%甲醇50 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻至室溫，補足重量。過濾，棄去初濾液，即得供試品溶液。進樣前，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

取S7訶子藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次。選擇17號峰為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.31%，相對峰面積的RSD均小于2.94%，儀器精密度符合要求。

2.3.1 重復(fù)性試驗

取S7訶子藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣。以17號峰為參照，共有峰的相對保留時間RSD均小于1.87%，相對峰面積RSD均小于2.97%，說明所建立的方法重復(fù)性符合要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取S7訶子藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在制樣后0，2，4，8，12，24 h進樣。以17號峰為參照，共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.67%，相對峰面積的RSD均小于2.97%，說明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 訶子HPLC指紋圖譜建立及相似度評價

分別取10批訶子藥材粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液進行測定。采用相似度評價系統(tǒng)（2004A版）對10批訶子藥材色譜數(shù)據(jù)（圖1）進行分析。以S7樣品指紋圖譜為參照圖譜，采用“平均數(shù)”法生成訶子藥材HPLC對照圖譜R，標定共有峰17個，選擇峰面積較大且穩(wěn)定存在的17號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。將10批訶子藥材指紋圖譜與對照圖譜R比較，進行相似度計算，10批訶子藥材相似度分別為0.984-0.999之間，相似度良好(表2)。

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1 HCA

將10批訶子共有峰峰面積色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0軟件中，Z標準化處理后，采用Ward法，以平方Euclidean距離為度量標準，進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果(圖2)。根據(jù)聚類分析結(jié)果，將訶子藥材大致分為4大類，I類包括S3、S4、S5；II類包括S7、S8、S9；III類包括S1、S10；Ⅳ 類包括S2、S6。

2.5.2 PCA

圖1 不同批次訶子藥材HPLC指紋圖譜

以10批訶子藥材的17個共有峰的峰面積為變量，用SIMCA 13.0軟件進行主成分分析，以主成分的特征根和貢獻率作為選擇主成分的依據(jù)。共有5個主成分的特征根大于1，其特征值分別為7.074、3.470、2.205、1.892、1.213，它們的方差貢獻率分別為41.612%、20.411%、12.969%、11.131%和7.137%，累積方差貢獻率大于93.261%。根據(jù)樣品主成分得分圖（圖3），可更直觀明顯看到10批樣品被分為4類，與HCA分析結(jié)果一致。

2.5.2 PLS-DA

利用SIMCA 13.0軟件建立PLS-DA模型，擬合得到最佳潛變量數(shù)為6，模型的R2X、R2Y和Q2Y分別為0.801、0.992和0.889，表明該模型對數(shù)據(jù)具有較好的擬合和預(yù)測能力。在PLS-DA得分圖中，樣品可很好的區(qū)分為4類，與HCA、PCA分析結(jié)果一致。VIP圖能夠反映每個X變量在區(qū)分樣本時的貢獻程度，以VIP＞1為原則，得出5、11、1、10、12號峰可能是區(qū)分樣品最關(guān)鍵的色譜峰，對樣品分類作用較大，經(jīng)指認，1、5號峰分別為沒食子酸、沒食子酸甲酯(圖4)。

3 總結(jié)與討論

本實驗比較了40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇為提取溶劑，結(jié)果顯示，以60%甲醇為提取溶劑時，所得指標性成分峰面積較大，提取率高。比較了60%甲醇超聲提取20 min、40 min、1 h的效果，結(jié)果顯示，提取1 h的提取率最高，故本實驗采用60%甲醇超聲提取1 h，作為供試品溶液制備方法。

對樣品進行全掃描，以色譜峰數(shù)、峰面積和分離效果為指標，比較不同波長下的色譜圖。結(jié)果表明，270 nm條件下得到色譜峰數(shù)目最多且各色譜峰分離良好，因此選定270 nm為檢測波長。

表2 不同批次訶子藥材相似度結(jié)果

圖2 不同批次訶子藥材聚類分析結(jié)果

本研究測定10批不同來源訶子藥材的HPLC指紋圖譜，采用相似度評價系統(tǒng)對色譜數(shù)據(jù)進行分析，標定17個共有峰，10批藥材相似度在0.984～0.999之間，表明所含化學(xué)成分基本相同，差異不大，推測其內(nèi)在成分含量的差異與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境、保存方法等因素有關(guān)。采用對照品對照的方法指認出其中的7個共有峰，分別為1號沒食子酸、4號安石榴苷A、5號沒食子酸甲酯、7號安石榴苷B、8號柯里拉京、15號五沒食子酰葡萄糖、17號鞣花酸。

圖3 不同批次訶子藥材PCA得分圖

圖4 不同批次訶子藥材PLS-DA分析結(jié)果

主成分分析得分圖和偏最小二乘判別分析得分圖均將樣品分為4類，與聚類分析結(jié)果較為一致，說明聚類分析與主成分分析和偏最小二乘判別分析的結(jié)合能對指紋圖譜進行更好地識別。偏最小二乘判別推測找到色譜峰5（沒食子酸甲酯）、11、1（沒食子酸）、10、12可能是鑒別訶子樣品最主要的色譜峰，可引導(dǎo)發(fā)現(xiàn)訶子中起決定性作用的化學(xué)成分，從而為其質(zhì)量評價及資源利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。