廣藿香超聲輔助提取工藝考察＊

朱浩東，吳卓娜，吳衛(wèi)剛，王 冰，張 彤＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 上海 201203；2.河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司安國 071200；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心 上海 201203）

廣藿香藥材為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.的干燥地上部分，具有芳香化濁，和中止嘔，發(fā)表解暑之功效[1]。廣藿香的化學(xué)成分包括揮發(fā)油、黃酮和生物堿等[2]，揮發(fā)油為其主要活性成分[3]，具有抗炎、抗真菌[2]、鎮(zhèn)痛[4]、化痰止咳[5]、殺蟲抑菌[6，7]等藥理作用。廣藿香揮發(fā)油中廣藿香醇（Patchouli alcohol，PA）含量最高[8]，亦稱百秋李醇，是一種三環(huán)倍半萜類小分子揮發(fā)性化合物[2]。2015版《中國藥典》將廣藿香醇作為廣藿香藥材及廣藿香油的含量測定指標(biāo)[1，9]。

目前，廣藿香醇含量測定法主要為氣相色譜法[10-16]。現(xiàn)有的廣藿香油及廣藿香醇的提取方法，主要有浸提法[17]、CO2超臨界萃取法（SFE-CO2）[18，19]、水蒸汽蒸餾法[18，20]及三氯甲烷超聲輔助提取法[1，21]等 。 其中，浸提法耗時過長，SFE-CO2法所需設(shè)備昂貴，水蒸汽蒸餾法耗能較大，而超聲輔助提取法具有提取時間短、提取效率高的特點，可防止一些不穩(wěn)定物質(zhì)在高溫和長時間提取條件下發(fā)生降解、褪色等變化[22，23]，適合于以廣藿香揮發(fā)油或廣藿香醇的提取工藝。但現(xiàn)有的三氯甲烷超聲輔助提取法，所用提取溶劑安全性不佳，考察以安全性更好的乙醇為溶劑進(jìn)行廣藿香超聲輔助提取非常有必要。因此，本文以提取時間（min），乙醇濃度（%）和液料比（mL·g-1）為影響因素，以提取物中廣藿香醇的含量為考察指標(biāo)，利用單因素試驗優(yōu)化廣藿香超聲輔助提取工藝，并用GC-FID法測定廣藿香醇含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

氣相色譜儀（7890B，美國Agilent公司）；氫火焰離子化檢測器（Agilent公司）；超聲波清洗機(jī)（SB5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；粉碎機(jī)（上海廣沙工貿(mào)有限公司）；電子分析天平（XS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司）；電子天平（BS124S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHBIIIS，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑

圖1 空白溶劑、內(nèi)標(biāo)溶液、對照品溶液及供試品溶液GC-FID色譜圖

廣藿香醇對照品（99%，110772-201608，中國食品藥品檢定研究院）；正十八烷（20160706，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純化水；乙醇除特殊標(biāo)記，均為95%乙醇，其余試劑均為分析純。廣藿香飲片（莖和葉）采購自廣東道地良藥館（0016M60913），經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)張紅梅博士鑒定為廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.，現(xiàn)保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]

彈性石英毛細(xì)管柱（Agilent HP-5：30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度150℃，保持23 min，以3℃·min-1的速率升至230℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：280℃；檢測器溫度：280℃；分流比：20:1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取廣藿香醇對照品35.57 mg，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解定容，搖勻，制成濃度為3.557 mg·mL-1的對照品貯備液[24，25]，置 4℃冰箱冷藏備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取正十八烷507.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加正己烷溶解定容，搖勻，制成濃度為5.070 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱冷藏備用。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，加入60 mL95%乙醇，超聲提取30 min，濾過，收集濾液，回收溶劑至干，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物[25]，轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.5 專屬性考察

精密稱取一定量廣藿香粗粉，按“2.4供試品溶液的制備”方法，制得樣品溶液。分別取空白乙醇溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下條件，進(jìn)樣GC系統(tǒng)測定。比較空白乙醇溶液及內(nèi)標(biāo)溶液對廣藿香醇的測定有無干擾。結(jié)果表明，在該方法下空白溶劑和內(nèi)標(biāo)物正十八烷對廣藿香醇的測定無干擾（圖1）。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取廣藿香醇對照品貯備液2000、1000、800、600、400、200、100 μL于5 mL量瓶，精密加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為1.4228、0.7114、0.5691、0.4268、0.2846、0.1423和0.0711 mg·mL-1的系列廣藿香醇對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取1μL續(xù)濾液注入氣相色譜儀，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，廣藿香醇對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。得線性回歸方程為y=1.8104x+0.0031，r=0.9999，結(jié)果表明，廣藿香醇在0.0711-1.4228 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度考察

2.7.1 日內(nèi)精密度

精密吸取 0.1423、0.4268、0.7114 mg·mL-1的低、中、高三個濃度的廣藿香醇對照品溶液，按“2.1”項下條件，分別連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計算RSD值。RSD值分別為0.17%、0.73%、0.22%。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.7.2 日間精密度

精密吸取 0.1423、0.4268、0.7114 mg·mL-1的低、中、高三個濃度的廣藿香醇對照品溶液，按“2.1”項下條件，連續(xù)3天，每天重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積并計算RSD值。RSD值分別為0.73%、1.02%、1.17%。

2.8 重復(fù)性考察

按“2.4供試品溶液的制備”方法，平行制備6份樣品溶液，進(jìn)樣GC系統(tǒng)測定廣藿香醇含量，并計算RSD值。RSD為0.88%，表明該方法重復(fù)性好。

2.9 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣GC系統(tǒng)測定，記錄峰面積并計算RSD值。RSD值為0.56%，表明樣品在測定的24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的廣藿香粗粉9份，每份1.50 g，分為低、中、高濃度3組，每組3份，分別加入相當(dāng)于樣品含量50%、100%和150%的廣藿香醇對照品溶液，按“2.4供試品溶液的制備”方法制得樣品溶液，按“2.1”項下GC條件測定廣藿香醇的含量，并計算低、中、高三個濃度的加樣回收率。

在50%、100%和150%的對照品加入量下，廣藿香醇測定方法的平均回收率分別為98.88%、98.36%和102.18%，且RSD值均＜3.00%，說明該方法回收率較好（表1）。

3 提取工藝考察

3.1 提取時間考察

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，平行3份，加入48 mL乙醇溶液，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，濾過，收集濾液，回收溶劑，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物，轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”項下條件，進(jìn)樣GC系統(tǒng)測定廣藿香醇含量。由圖2可知，隨著提取時間延長，當(dāng)提取時間在20-30 min時，廣藿香醇含量不斷增加；但當(dāng)提取時間超過30 min以上時，廣藿香醇含量并未隨提取時間延長而增加。因此，選擇超聲提取30 min較為適宜。

3.2 乙醇濃度考察

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，平行三份，分別加入80%、85%、90%、95%、100%濃度的乙醇溶液48 mL，超聲提取30 min，濾過，收集濾液，回收溶劑，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物，轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”項下條件，進(jìn)樣GC系統(tǒng)測定廣藿香醇含量。當(dāng)乙醇濃度在80%-90%范圍內(nèi)時，提取物中廣藿香醇含量的升高趨勢較?。划?dāng)乙醇濃度由90%-95%時，提取物中廣藿香醇含量增加較大；當(dāng)乙醇濃度為100%時，廣藿香醇含量并無明顯提高（圖3）。因此，選擇95%濃度乙醇作為提取溶液較適宜。

3.3 液料比考察

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，平行3份，分別加入24、36、48、60、72 mL乙醇溶液，超聲提取30 min，濾過，收集濾液，回收溶劑，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物，轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”項下條件，進(jìn)樣GC系統(tǒng)測定廣藿香醇含量。當(dāng)料液比在8∶1-20∶1 mL·g-1時，廣藿香醇含量呈上升趨勢，并且在20∶1 mL·g-1時含量最高；當(dāng)液料比增大至24∶1時廣藿香醇含量并無提高（圖4）。因此，確定液料比為20∶1 mL·g-1較為適宜。

圖2 提取時間對廣藿香醇含量的影響（n=3）

圖3 乙醇濃度對廣藿香醇含量的影響（n=3）

圖4 液料比對廣藿香醇含量的影響（n=3）

4 討論與總結(jié)

廣藿香醇為廣藿香的主要活性成分，為一種揮發(fā)性的小分子化合物，不溶于水，而溶于醇、醚等有機(jī)溶劑。然而廣藿香醇不易從廣藿香中直接提取，故常以廣藿香提取物或廣藿香油作為藥用成分。目前關(guān)于廣藿香提取工藝的報道，較少以乙醇作為提取溶劑，且多以出油率作為考察指標(biāo)。受生長條件、提取工藝等因素影響，出油率并不一定能反映廣藿香醇含量。因此，以廣藿香醇含量為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化有一定的必要性。

因文獻(xiàn)報道廣藿香乙醇提取物不能完全溶于正己烷[25]，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)以正己烷溶解本實驗乙醇提取物時亦有溶解不完全現(xiàn)象，而研究報道廣藿香醇在95%乙醇中溶解性好[24]，因此，為保證提取物中廣藿香醇能夠提取完全，在供試品溶液制備時，本文選擇更為安全綠色的95%乙醇作為供試品溶液制備的提取溶劑，而未選用藥典中測定藥材所使用的正己烷作為供試品處理溶劑。

本文以廣藿香醇含量為指標(biāo)，從對于提取效果影響較大的提取時間、乙醇濃度、料液比三個主要因素進(jìn)行單因素考察，確定適宜廣藿香藥材最佳超聲輔助提取條件為：超聲時間30 min，乙醇濃度為95%，液料比20∶1 mL·g-1。在該工藝條件下，廣藿香醇提取率為32.75%，含量為0.15%（按干燥藥材計）。該法便于產(chǎn)業(yè)化操作，安全無污染，為廣藿香醇的工業(yè)超聲輔助提取工藝的應(yīng)用提供了實驗室依據(jù)。